Образован в 1953 году




НазваниеОбразован в 1953 году
страница5/6
Дата публикации02.09.2013
Размер0.65 Mb.
ТипЛабораторная работа
zadocs.ru > География > Лабораторная работа
1   2   3   4   5   6

Лабораторная работа № 5.

Обнаружение, идентификация и определение остаточных количеств левомицетина в продуктах животного происхождения хроматографическим методом анализа

Общие сведения: Среди ряда посторонних веществ, которые могут загрязнять различные пищевые продукты, важное место занимают лекарственные средства, в частности антибиотики, широко применяемые в ветеринарии и животноводстве, что предопределяет необходимость проведения соответствующих мероприятий для снижения уровня загрязненности продуктов этими веществами, а также организации контроля за остаточными количествами препаратов в продуктах животного происхождения.

При систематическом поступлении в организм человека с пищей антибиотики могут вызывать различные аллергические реакции, нарушение обмена веществ, дисбактериоз, изменять микрофлору и т.д. Следует учитывать возможность отрицательного влияния антибиотиков в сырье для пищевой промышленности на проведение ряда технологических процессов по переработке мяса, рыбы, молока и др. продуктов.

Левомицетин (хлормицетин, хлорамфеникол) – эффективный синтетический антибиотик широкого спектра действия, запрещен к использованию в ветеринарии и животноводстве для лечения скота и птицы, мясо, молоко и яйца которых предназначены для питания людей, что связано с высокой токсичностью левомицетина. Однако относительная дешевизна этого препарата и высокая антибактериальная активность приводят к нелегальному использованию его в относительно высоких масштабах.

Как правило, для контроля уровней содержания антибиотиков в том числе, левомицетина, используют микробиологические методы определения. Однако вследствие недостаточной чувствительности и эффективности этих методов, а также их большой трудоемкости и длительности проведения анализов в настоящее время наиболее часто применяют химические методы определения антибиотиков в пищевых продуктах с использованием хроматографического разделения.

Сущность метода: Контроль остаточных количеств левомицетина в пищевых продуктах проводится с помощью простого химического метода анализа, основанного на извлечении антибиотика экстракцией органическим растворителем, концентрировании экстракта, отделении левомицетина в тонком слое силикагеля от коэкстрактивных веществ и определении его после восстановления в виде производного с n-диметиламинобензальдегидом. Этот метод рекомендован для серийных анализов пищевых продуктов в условиях санэпидстанций, заводских и сельскохозяйственных лабораторий. Предел обнаружения левомицетина на хроматографической пластинке 5-10 нг в зоне. Относительное стандартное отклонение при визуальном определении не превышает 0,4, при спектрофотометрическом - 0,2. Метод позволяет проводить анализ левомицетина при содержании его 0,05 мг/кг продукта и выше.

Аппаратура, материалы и реактивы:

Гомогенизатор тканей; спектрофотометр СФ-26 или аналог; термостат; азот, поверочный нулевой газ; центрифуга настольная; ротационный испаритель с ловушкой; баня масляная или глицериновая; камера для тонкослойной хроматографии с притертой крышкой; пластины для тонкослойной хроматографии «Силуфол» размером 15х15 см, ЧСФР или Сорбфил 100х100 (г.Краснодар); ножницы; весы технические; весы аналитические; линейка; карандаш графитовый; цилиндры мерные вместимостью 50 и 100 см3; колбы плоскодонные на 25 и 100 см3; колбы мерные на 25 см3; пипетки на 5 и 10 см3; колбы для упаривания на 25 и 50 см3; микрошприц на 10 и 25 мкл; натрий сернокислый, безводный; серная кислота, х.ч., 1 н раствор; этилацетат, х,ч.; натрий хлористый, насыщенный раствор в воде; натрий углекислый, х.ч., 2% водный раствор; ацетонитрил; петролейный эфир, фракция 40-70° С; метанол; β-глукуронидаза, водный раствор 1 мг/мл; вода дистиллированная; кислота соляная, конц.; хлорид олова (II), восстанавливающий реактив: 3 см 15% раствора SnCl2 (в воде) + 15 см3 НСlконц.+180 см3 Н2О; левомицетин; однозамещенный фосфат калия; двузамещенный фосфат натрия.

Отбор и подготовка проб: Способ отбора и подготовки проб указан в нормативно-технической документации на конкретную продукцию.

Извлечение левомицетина из пищевых продуктов и концентрирование экстракта:

Мясо, мясные продукты. 10±0,1 г гомогенизируют с 15 см3 0,025 М фосфатного буфера, рН 6,88 (0,34 г КН2РО4 и 0,36 г Nа2НРО4 растворяют в 100 см3 дистиллированной воды), добавляют 200 мкл водного раствора β-глукуронидазы и инкубируют 1,5 часа при 37° С. Гомогенат экстрагируют 3х30 см3 этилацетата, при необходимости применения для расслоения суспензии центрифугирование 5-10 мин при 4000 об/мин. Этилацетатный слой объединяют.

Молоко, молочные и кисломолочные продукты (при анализе сметаны ее разбавляют в 2,5-5 раз в зависимости от жирности, сыры и творог гомогенизируют с водой до получения гомогенной массы).25±0,1 см3 насыщают 10 г Na24, приливают 40 см3 этилацетата и 5 см3 1 н Н24, интенсивно встряхивают 1-2 мин. Для расслоения эмульсии применяют центрифугирование 5-10 мин при 4000 об/мин. Этилацетат декантируют, а супернатант экстрагируют последовательно 30 и 20 см3 этилацетата, при необходимости применяя центрифугирование для расслоения.

^ Яйцо (яичный порошок предварительно разводят водой до консистенции жидкой сметаны). 10±0,1 г гомогената яйца перетирают с 5 г Na24, приливают 40 см3 этилацетата и 5 см. 1 н Н24, перемешивают и центрифугируют 5-10 мин при 4000 об/мин. Этилацетатный слой декантируют, а водную часть экстрагируют последовательно 30 и 20 см3 этилацетата, при необходимости применяя центрифугирование для расслоения. Объединенные этилацетатные экстракты из продуктов промывают последовательно 10 см3 2% раствора Nа2СО3, насыщенного NаС1 и 10 см3 насыщенного раствора NаСI.

Органический слой отбирают и упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 50° С до минимального объема, отдувают азотом до исчезновения запаха этилацетата, добавляют 3 см3 смеси ацетонитрил – вода 1:4 и экстрагируют 3·5 см3 петролейного эфира. Петролейный эфир отбрасывают и извлекают левомицетин этилацетатом (3х5 см3). Этилацетатный экстракт сушат над Na24 (1 г), декантируют, промывают 3 см3 этилацетата сульфат натрия, объединяют его с экстрактом и упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 50° С досуха. Остаток растворяют в 200 мкл метанола.

Хроматографическое разделение: идентификация и ориентировочная оценка концентрации левомицетина в экстракте.

Приготовление стандартных растворов: Отвешивают 25 мг левомицетина, помещают в мерную колбу на 25 см3 и растворяют в метаноле, концентрация левомицетина – 1 мг/см3. 0,25 см3 полученного раствора помешают в мерную колбу на 25 см3 и разбавляют метанолом. Концентрация левомицетина в стандартом растворе 10 нг/мкл.

Хроматографическое разделение: На пластинку для тонкослойной хроматографии наносят (рис. 2 А): в точки 1,3 и 5 соответственно 1,2 и 4 мкл раствора стандарта, а в точки 2 и 4 соответственно 3 и 10 мкл концентрированного экстракта.

Пластинку помещают в камеру для ТСХ и хроматографируют в системе растворителей хлороформ-метанол 10:1. По достижении фронтом элюента верхнего края пластинки, ее вынимают, сушат, опрыскивают раствором SnCl2 в НС1, оставляют на 15 мин и опрыскивают раствором n-диметиламинобензальдегида. Появление желтых пятен на хроматографической пластинке, по оттенку и Rf соответствующих пятнам стандарта, свидетельствует о возможном присутствии левомицетина в продукте. Сравнивая интенсивность окраски пятен стандартов и опытной пробы, ориентировочно оценивают содержание левомицетина в экстракте.

Подтверждение наличия левомицетина в пробе: Аликвотную часть экстракта (50-100 мкл) упаривают досуха, добавляют 150 мкл 10% раствора НС1, греют на масляной бане при температуре 98° С в течение 30 мин, отдувая досуха азотом и приливают 200 мкл 2% метанольного раствора Na2СО3.

На хроматографическую пластинку наносят 1-10 мкл полученной пробы и соответствующее количество стандарта левомицетина (с учетом предварительной оценки содержания левомицетина в экстракте); пластинку помещают в камеру для ТСХ и хроматографируют в системе растворителей хлороформ-метанол-уксусная кислота-вода 12:5:4:2.

По достижении фронтом элюента верхнего края пластинки, ее вынимают, сушат, опрыскивают раствором SnСl2 в НСl, оставляют на 15 мин и вновь опрыскивают раствором n-диметиламинобензальдегида. Появление желтых пятен на хроматографической пластинке по оттенку и Rf соответствующих пятнам стандарта, подтверждает наличие левомицетина в продукте.

Количественное определение и расчет содержания левомицетина в продукте: При необходимости точного количественного определения левомицетина в пищевом продукте на хроматографическую пластинку наносят в несколько точек, близко расположенных друг к другу, аликвотную часть экстракта и таким же образом раствор стандарта, так, чтобы количество левомицетина в нем было близко к установленному в пробе при ориентировочной визуальной оценке. Пластинку хроматографируют и опрыскивают как в п.

Хроматографическое разделение: Вырезают зоны левомицетина в опытной пробе, стандарта и соответствующую по Rf и площади зону на пластинке, служащую контролем (рис.2Б). Зоны элюируют 3х1 см3 метанола, метанол упаривают досуха, приливают 200 мкл 5% раствора SnCl2 в 5% НСl, греют при температуре 98° С в течение часа; пробы охлаждают, добавляют по 2 см3 1% раствора n-диметиламинобензальдегида в метаноле, 1 см3 метанола и измеряют оптическую плотность полученных растворов опытной пробы и стандарта относительно контрольной пробы на спектрофотометре в кюветах с 1=10 мм при λ = 430 нм.

Рассчитывают содержание левомицетина в пробе продукта по формуле:



К - коэффициент, учитывающий полноту извлечения левомицетина из пищевого продукта и равный: 1,33 для мяса; 1,13 - для молока и 1,25 - для яиц; ОПо - оптическая плотность элюата опытной пробы, относ. ед.; ОПст. - оптическая плотность элюата стандарта, относ. ед.; Р - количество стандарта левомицетина, нанесенного на пластинку, мкг; V - объем анализируемой пробы, мкл; М - масса образца пищевого продукта, кг (л). Интервал определяемых масс левомицетина составляет 0,5-6,0 мкг. Вычисления проводят до второго десятичного знака. За окончательный результат испытаний принимают среднее арифметическое двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает 20%. Окончательный результат округляют до первого десятичного знака.

а. линия фронта б.

растворителей
10см



I II III






1 2 3 4 5 линия старта
Рис. 2 Схема нанесения на хроматографическую пластинку стандарта и аликвотных частей экстракта из продукта: а) при визуальной оценке содержания левомицетина в пробе: 1, 3, 5 – точки нанесения 1, 2, 4 мкл раствора стандарта соответственно; 2, 4 – точки нанесения экстракта 3 и 10 мкл соответственно; б) при количественном определении: I, II и III – зоны опытной пробы, стандарта и контроля соответственно.

Контрольные вопросы:

  1. В чём заключается хроматографический метод анализа?

  2. Основные принципы метода тонкослойной хроматографии?

  3. Каковы свойства левомицитина?

  4. Сущность метода тонкослойной хроматографии левомицитина?

  5. Особенности экстракции левомицитина из пищевых продуктов?


Лабораторная работа №6

Определение бензойнокислого натрия в продуктах консервирования тириметрическим методом анализа
Сущность метода: Метод основан на титровании бензойной кислоты, экстрагированной хлороформом или этиловым эфиром из безбелковой водной вытяжки, щелочью в присутствии фенолфталеина.

Аппаратура, реактивы

Весы лабораторные общего назначения

Колбы мерные вместимостью 500 и 100 см3;

цилиндры мерные вместимостью 50 и 100 см3;

чашки выпарительные; воронки делительные;

колбы круглодонные вместимостью 250 см3;

бюретки; пипетки мерные; капельницы; палочки стеклянные;

баня водяная;

бумага фильтровальная

марля медицинская;

бумага индикаторная лакмусовая;

цинк сернокислый, ч.д.а.,

раствор массовой концентрации 300 г/дм3;

калий железисто-синеродистый, ч.д.а.,

раствор массовой концентрации 150 г/дм3;

кислота серная, ч. раствор 1:1;

натрия гидроксид, ч.д.а.,

раствор массовой концентрации 100 г/дм3 и 0,05 моль/дм3;

фенолфталеин,

хлороформ;

эфир этиловый, ч.д.а.,

спирт этиловый

кислота бензойная, ч.д.а,

калий йодистый, ч.д.а,,

раствор массовой концентрации 20 г/дм3;

калия гадроксид, ч.д.а,

кислота соляная, х.ч., раствор с массовой долей 10 %;

крахмал растворимый, раствор массовой концентрации 10 г/дм3;

вода дистиллированная.

Подготовка к анализу:

При работе с этиловым эфиром его проверяют на присутствие перекисей и при наличии их проводят очистку.

Присутствие перекисей обнаруживают по выделению йода из подкисленного раствора йодистого калия.

В пробирку с 2-3 см3 эфира добавляют равный объем раствора йодистого калия, подкисленного 3-5 каплями раствора соляной кислоты, и хорошо встряхивают в течение 1-2 мин. При наличии перекисей выделяющийся йод может быть обнаружен по бурому окрашиванию эфирного слоя или по появлению синего окрашивания при добавлении к пробе 1 см3 раствора крахмала.

Для очистки этилового эфира от перекисей в колбы с 65-70 г порошкообразного гидроксида калия добавляют около 1 дм3 этилового эфира.

Содержимое встряхивают в течение 3 мин. После отстаивания проверяют эфир на отсутствие перекисей, фильтруют через бумажный складчатый фильтр и хранят в темном месте.

Проведение испытания:

Из подготовленной пробы отвешивают 100 г в выпарительную чашку и количественно переносят ее дистиллированной водой в мерную колбу вместимостью 500 см3, доводя объем в колбе до 250-300 см3.

Содержимое колбы подщелачивают до рН 7,5-8,0 (по лакмусу или универсальной индикаторной бумаге) раствором гидроксида натрия массовой концентрации 100 г/дм3, нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин, затем охлаждают до комнатной температуры.

В колбу приливают 20 см3 раствора железистосинеродистого калия и 20 см3 раствора сернокислого цинка, осторожно перемешивая содержимое после прибавления каждого реактива. Объем в колбе доводят дистиллированной водой до метки, закрывают ее пробкой, хорошо перемешивают, оставляют на 30 мин и фильтруют в сухую колбу сначала через двойной слой марли, а затем через бумажный складчатый фильтр. Фильтрат должен быть прозрачным.

100 см3 полученного фильтрата количественно переносят в делительную воронку, нейтрализуют (по лакмусу или универсальной индикаторной бумаге) раствором серной кислоты и добавляют еще 2 см3 указанного раствора серной кислоты при экстракции эфиром. При экстракции хлороформом допускается подкисление соляной кислотой.

При использовании этилового эфира экстракцию бензойной кислоты проводят два раза 50 см3 эфира осторожными вращательными движениями делительной воронки в течение 5 мин.

Объединенные в делительной воронке эфирные вытяжки промывают дистиллированной водой три раза по 15 см3, удаляя каждый раз нижний водный слой после отстаивания. Водная фаза последней промывки должна иметь нейтральную реакцию по лакмусу или универсальной индикаторной бумаге.

Эфир из делительной воронки сливают в колбу и отгоняют или выпаривают досуха при температуре водяной бани не выше 40° С.

При использовании хлороформа экстракцию проводят четыре раза, последовательно 35, 25, 20 и 15 см3 хлороформа.

Каждую экстракцию проводят в течение 5 мин осторожными вращательными движениями делительной воронки. После разделения слоев хлороформ сливают в сухую перегонную колбу, не захватывая водного слоя. При попадании водного слоя в хлороформную вытяжку ее переносят из колбы в чистую делительную воронку и промывают 15 см3 дистиллированной воды.

Хлороформный слой из делительной воронки сливают в сухую перегонную колбу и отгоняют 3/4 объема хлороформа на водяной бане при температуре 65-70° С, остаток выпаривают досуха при температуре (55±5)° С.

К сухому остатку в колбе после удаления эфира или хлороформа добавляют 30-50 см3 этилового спирта, нейтрального по фенолфталеину, 7-10 см3 дистиллированной воды, 2 капли фенолфталеина и титруют раствором гидроксида натрия с (NаОН) = 0,05 моль/дм3.

Обработка результатов:

Массовую долю бензойнокислого натрия (X) в процентах вычисляют по формуле



где V – объем раствора гидроксида натрия 0,05 моль/дм3, израсходованный на титрование, см3; К - коэффициент пересчета на точный 0,05 моль/дм3 раствор гидроксида натрия; 0,0071 - количество бензойнокислого натрия, соответствующее 1 см3 точного раствора 0,05 моль/дм3 гидроксида натрия, г; V1 - объем фильтрата, взятый для экстракции, см3; V2 – общий объем пробы, см3; m – масса исследуемого продукта, г.

Вычисление проводят до третьего десятичного знака. За результат испытания принимают среднее арифметическое значение двух параллельных определений, допускаемое расхождение между которыми не должно превышать 0,005. Результат округляют до второго десятичного знака.

При пересчете содержания бензойнокислого натрия, полученного с использованием этилового эфира, результаты испытания умножают на 0,88.
1   2   3   4   5   6

Похожие:

Образован в 1953 году iconОбразован в 1953 году
Настоящая работа является продолжением цикла учебно-практических пособий «Физика. Ч. 1 – Ч. 3»

Образован в 1953 году iconОбразован в 1953 году Кафедра физики и высшей математики
Министерство образования российской федерации московский государственный университет технологий и управления

Образован в 1953 году iconОбразован в 1953 году Кафедра физики Дистанционное обучение
В пособии даны общие методические указания по работе над курсом физики, список литературы, рекомендуемой для изучения курса, рабочая...

Образован в 1953 году iconРайон образован 20 августа 1930 года делением Аргаяшского кантона...
...

Образован в 1953 году icon1. Общая характеристика предприятия
Колхоз «Юбилейный» образован в 1968 году в результате реорганизации колхоза «Заря»

Образован в 1953 году iconГрани Агни Йоги 1953 год Часть I грани Агни Йоги. 1953 г
Записи Бориса Николаевича Абрамова, ближайшего ученика Н. К. Рериха, полученные из Высокого Источника, о чем имеется подтверждение...

Образован в 1953 году iconСоздания ветеринарного факультета послужила кафедра основ ветеринарии,...
С. М. Воробьёв, приехавший из Ленинграда. На кафедре с 1953 года работали доцент В. В. Куликов (основы ветеринарии и акушерства),...

Образован в 1953 году iconЯнтиковский район образован в 1935 г. Площадь 52,46 кв км, с/х угодий...
Янтиковский район образован в 1935 г. Площадь – 52,46 кв км, с/х угодий – 33,92 тыс га. Районный центр – с. Янтиково (здание администрации...

Образован в 1953 году iconРешением Моршанского городского Совета народных депутатов
Город Моршанск образован в долине реки Цны на месте старинного поселения Морша. Первые упоминания о поселении относятся к XVI в

Образован в 1953 году iconСвами Муктананда
Он основал Общину праведной жизни в Ришикеше в 1936 году, Аюрведическую аптеку Шивананды в 1945 году, Лесную академию Йога веданта...

Вы можете разместить ссылку на наш сайт:
Школьные материалы


При копировании материала укажите ссылку © 2013
контакты
zadocs.ru
Главная страница

Разработка сайта — Веб студия Адаманов