Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия»




НазваниеРуководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия»
страница11/40
Дата публикации18.08.2013
Размер4.46 Mb.
ТипРуководство
zadocs.ru > Химия > Руководство
1   ...   7   8   9   10   11   12   13   14   ...   40

Принцип метода. Метод основан на определении скорости образования пирувата в ходе окисления лактата с участием лактатдегидрогеназы сыворотки крови. Пируват с 2,4- динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) образует соответствующий гидразон, имеющий красно-бурое окрашивание в щелочной среде, интенсивность которого прямо пропорциональна содержанию кетокислоты:




ПВК 2,4-динитрофенолгидразин



2,4-динитрофенилгидразон ПВК

^ Ход определения. Сыворотку крови разводят в 3 раза дистиллированной водой. Вносят в пробирку 0,1 мл разведенной сыворотки, 0,3 мл раствора НАД + и ставят на 5 мин в водяную баню при 370С (для прогревания смеси).

Во вторую пробирку добавляют 0,8 мл раствора пирофосфата натрия и 0,2 мл раствора лактата натрия и нагревают на водяной бане при 370С.

Выливают содержимое второй пробирки в первую, быстро перемешивают стеклянной палочкой, не вынимая пробирки из бани, и отмечают время начала инкубации. Через 25 мин реакцию останавливают, прибавляя 0,5 мл раствора 2,4-ДНФГ, и оставляют пробирку на 20 мин при комнатной температуре (для образования гидразона).

К смеси приливают 5 мл раствора NaOH, содержимое перемешивают стеклянной палочкой и через 10 мин (после развития окраски) измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на ФЭКе при длине волны 520-560 нм (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 1см. Контрольную пробу готовят как опытную, но разведенную сыворотку добавляют после инкубации.

^ Расчет. Активность фермента рассчитывают по калибровочному графику.

Оформление работы. Рассчитать активность фермента в исследуемой сыворотке крови, сделать вывод о возможных причинах изменений активности фермента.

^ Практическое значение работы. Определение активности лактатдегидрогеназы используется в клинико-биохимических лабораториях для диагностики и установления прогноза заболевания. В норме активность фермента составляет 0,8- 4,0 ммоль/ (ч л) и возрастает, как правило, у больных с повреждением миокарда, скелетных мышц, почек, а также при анемиях, опухолевых поражениях, остром гепатите и т.д.
^ Работа № 3. Разделение изоферментов лактатдегидрогеназы сыворотки крови методом электрофореза в полиакриламидном геле

Использование в качестве среды геля полиакриламида позволяет добиться высокого разрешения при электрофорезе белков и ферментов, поскольку этот гель играет роль молекулярного сита, что обеспечивает дополнительное разделение частиц по молекулярной массе.

^ Метод основан на разной электрофоретической подвижности изоферментов ЛДГ, положение которых на столбиках полиакриламидного геля выявляется с помощью веществ, переносящих водород от лактата через феназинметасульфат на нитротетразолиевый синий. В результате в месте нахождения фракции ЛДГ выпадает фиолетово-синий осадок диформазана.

^ Ход определения. Для полимеризации геля берут сухие чистые стеклянные трубочки, закрывают их с одного конца резиновыми колпачками, устанавливают в штативе строго перпендикулярно и вносят в них каплю раствора сахарозы. Затем готовят полимеризующую смесь, состоящую из растворов №1, №2, персульфата аммония и дистиллированной воды в соотношении 1:2:4:1. смеси готовят из расчета 2 мл на одну трубочку.

Приготовленную полимеризующую смесь разливают в стеклянные трубочки, используя по 2 мл на каждую. Затем на поверхность этого раствора осторожно наслаивают 0,2-0,3 мл дистиллированной воды пипеткой с тонким оттянутым концом (это улучшает полимеризацию геля в трубочках, которая протекает без доступа кислорода воздуха, и формирует гладкую поверхность геля). Через 30 мин обычно полимеризация завершается, о чем свидетельствует ясно различимая граница между полиакриламидным гелем и водой. После этого переворачивают трубочки и осторожно стряхивают с геля наслоенную воду, а остатки воды удаляют из трубочки с помощью фильтровальной бумаги.

Стеклянные трубочки с заполимеризованным гелем закрепляют в гнездах верхней камеры для электрофореза. На поверхность геля в трубочке наносят сначала 0,1 мл сыворотки крови, затем такой же объем раствора сахарозы и перемешивают нанесенные жидкости стеклянной палочкой. Осторожно наслаивают на эту жидкость разведенный в 10 раз электродный буфер, заполняя им пространство до верхнего края трубочки.

Нижнюю камеру аппарата заливают тем же электродным буфером, устанавливают верхнюю камеру над нижней так, чтобы нижние концы трубочек были погружены в электродный буфер. Затем верхнюю камеру тоже заполняют электродным буфером.

Аппарат для электрофореза ставят в холодильник. Электроды подключают к источнику постоянного напряжения: нижний электрод к аноду, верхний - к катоду. В течение первых 10 мин электрофорез проводят при силе тока 2мА на каждую трубочку. Затем силу тока увеличивают до 4мА. Длительность электрофореза около 90 мин.

Пока идет электрофорез, для выявления изоферментов ЛДГ готовят в колбе инкубационную смесь следующего состава: растворы лактата натрия, хлорида натрия, хлорида магния, НАД – по 1 мл, фосфатного буфера и НС- по 2,5 мл и ФМС – 0,25 мл, перемешивают содержимое колбочки.

По окончании электрофореза гели извлекают из трубочек. Для этого используют шприц на 10-20 мл с тонкой длинной иглой. Вводят иглу между стенкой трубочки и гелем. Круговыми движениями отслаивают гель, постоянно выдавливая воду из шприца и продвигая иглу к противоположному концу трубки. При этом столбик геля легко выскакивает из трубки.

Столбик геля помещают в пробирки диаметром 7-8мм и наливают в них инкубационную смесь так, чтобы весь столбик геля был погружен в проявляющуюся жидкость. Пробирки ставят в термостат при 370 С на 40-60 мин. Изоферменты ЛДГ выявляются в виде сине-фиолетовых колец на столбике геля.

По истечении инкубации столбики геля промывают водой, переносят в пробирки содержащие раствор уксусной кислоты, и хранят в темноте.

Количественную обработку гелевых изоэнзимограмм проводят спектрофотометрическим методом или посредством денситометрии. В первом случае лезвием вырезают окрашенные участки геля, помещают их в пробирки и заливают 1 мл подогретого до +80-850С раствора диметилформамида. Затем окрашенную жидкость сливают в микрокюветы и измеряют экстинкцию на спектрофотометре или ФЭКе при 540 нм против раствора диметилформамида.

Второй способ обработки заключается в сканировании гелей на микроденситометре. Денситограммы подвергаются количественной обработке.

Расчет. Относительную активность каждого изофермента х (%) выражают в процентах от суммы экстинкций всех изоферментов ЛДГ:

Х=ЕА×100%

∑Е , где Е- экстинкция элюата изофермента из зоны геля, относящейся к данному изоферменту; ∑ Е- сумма экстинкций всех изоферментов; А- активность ЛДГ сыворотки крови, ммоль/(ч·л).

^ Оформление работы. Зарисовать полученную изоэнзимограмму и рассчитать относительную активность изоферментов ЛДГ (в %). Сделать вывод о сдвигах спектра изоферментов ЛДГ в исследуемой сыворотке и указать на вероятные причины этого явления.

^ Клинико-диагностическое значение. Состав изоферментов ЛДГ имеет внутриклеточную, тканевую и видовую специфичность. Тканевые различия изоферментого спектра ЛДГ явились предпосылкой для использования его в диагностике и прогнозе ряда заболеваний, сопровождающихся некрозом тканей и органов. Известно, что в сердечной мышце, нервной ткани, почках высокая активность ЛДГ1 и ЛДГ2 (изоферменты Н-типа), в поджелудочной железе и легочной ткани преобладает ЛДГ3, а в скелетной мышце и печени-ЛДГ4 и ЛДГ5 (изоферменты М-типа). При некрозе этих тканей находящиеся в них изоферменты поступают в кровь и изменяют ее нормальный спектр. В норме сыворотка крови имеет примерно следующие соотношения изоферментов (в % от общей активности): ЛДГ1-31, ЛДГ2-47, ЛДГ3-12, ЛДГ4-5, ЛДГ5- 4. При инфаркте миокарда увеличивается доля ЛДГ1 и ЛДГ2 (спектр смещается в сторону изоферментов Н-типа), причем этот сдвиг определяется размерами очага некроза в сердце. Заживление сопровождается нормализацией состава изоферментов в сыворотке крови.

При инфекционном гепатите повышена относительная активность ЛДГ4 и ЛДГ5. Если она сохраняется при клиническом выздоровлении, то это свидетельствует о незавершенности восстановительных процессов в печени.

При поражении поджелудочной железы (панкреатит), легочной ткани увеличивается относительная активность ЛДГ3 в сыворотке крови. Увеличение активности изоферментов средней зоны ЛДГ3 и ЛДГ4 наблюдается также при массивном разрушении тромбоцитов (эмболии легочной артерии, массивные гемотрансфузии) и вовлечении в патологический процесс лимфатической системы.
^ УИРС. Исследование амилазной активности мочи.

Исследование амилазной активности мочи по Вольгемуту производится аналогично методике приведенной выше для определения активности амилазы слюны). Амилазная активность мочи также отражает и величину клубочковой фильтрации. Снижение активности этого фермента в моче наблюдается при почечной недостаточности. В норме амилазная активность мочи по Вольгемуту составляет от 16 до 64 Е.

Для определения активности амилазы можно использовать также модификацию Бюхнера. По данному методу амилазная активность мочи выражается количеством фермента, расщепляющим 2 мг крахмала за 15 мин.

^ Ход работы. На сухую чашку Петри заранее капают в разных местах по 1 капле раствора Люголя (всего 8-10 капель). В пробирку вносят 2 мл 0,1% р-ра крахмала (2 мг крахмала), 1 мл физиологического р-ра и помещают пробирку на водяную баню при 37°С на 2 мин. Через 2 мин, не вынимая пробирку из бани, добавляют в нее 05 мл мочи, перемешивают и отмечают время начала реакции. Затем каждые 2-3 мин переносят каплю реакционной смеси на чашку Петри в раствор Люголя до тех пор, пока не произойдет полное разложение крахмала, т.е. до появления желтого цвета

Активность амилазы рассчитывают по формуле:

Хед=15/Т×0,5 ,

где х- активность амилазы в 1 мл мочи;

15 – время, необходимое для полного расщепления 2 мг крахмала;

0,5 – количество мочи, взятое на анализ, мл;

Т- время реакции, мин.

В норме активность амилазы мочи по Бюхнеру составляет 1-2 ЕД.
Эталоны ответов к тестовым заданиям

Вид 1. 1.1. – в; 2 –а.

Вид 2. 2.1. 1-В; 2-г; 3-а; 4-д; 5-б;

2.2. 1-а; 2-б; 3-в;

2.3. 1-е; 2- а, б; 3-г; 4-г; 5-д; 6-а, б, в.

Вид 3. 3.1.- 4; 3.2.- 1,2,3.

Вид 4. 4.1.- А (+, +, +); 4.2.- С (+, -, -).
Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1. Молярная активность (число оборотов) – это количество молекул субстрата, превращаемое одной молекулой фермента за единицу времени. Молярная активность выражается в единицах Кат/г-моль фермента, либо Е/мкмоль фермента. Таким образом, молярная активность лактатдегидрогеназы составляет 9,6:0,002=4,8∙103 мин-1.
Задача 2. Катал – количество фермента, преобразующее моль субстрата в секунду (моль/сек). Активность фермента составляет 5 нКат, т.е. фермент преобразует 5•10 -9 моль субстрата в сек, следовательно, за 20 секунд - 5•20•10 -9 = 1•10 -7моль субстрата. Для перевода в граммы умножим эту величину на молярную массу субстрата (исходя из формулы ν=m/Mr):

1 •10 -7•672=672•10 -7грамм субстрата.
Задача 3. Для инфаркта миокарда характерно увеличение сывороточной активности ферментов аминотрансфераз – аспарагиновой и аланиновой), лактатдегидрогеназы (изофермент ЛДГ1), креатинкиназы 2 (изофермент-МВ). Определение активности этих ферментов поможет в подтверждении диагноза.
^ Занятие № 8. Зачетное занятие по модулю «Белки. Ферменты».

Цель занятия: проверить и закрепить знания студентов о белках, ферментах и методах их анализа, имеющих значение для клинической медицины.
^ Содержание занятия. Студентам предстоит пройти компьютерное тестирование, дать письменные ответы на контрольные вопросы и пройти индивидуальное собеседование с преподавателем.
^ Контрольные вопросы к модулю «Белки. Ферменты»

1. Общая характеристика, элементарный состав, история изучения белков. Формирование представления о белках как о классе соединений и важнейшем компоненте живых организмов. Исследования Мульдера, Данилевского, Фишера и др.

2. Структура, свойства, классификация и общая характеристика протеиногенных аминокислот.

3. Первичная структура белков (умение писать структуры пептидов). Зависимость биологических, свойств белков от первичной структуры. Методы исследования первичной структуры.

4. Конформация пептидных цепей в белках (вторичная, надвторичная и третичная структуры). Слабые внутримолекулярные взаимодействия в пептидной цепи; дисульфидные связи.

5. Четвертичная структура белков. Кооперативные изменения конформации протомеров на примере гемоглобина, аллостерических ферментов.

6. Биологические функции белков. Способность к специфическим взаимодействиям. И пецифическое узнавание как основа биологических функций всех белков. Комплементарность структуры центра связывания белка и лиганда; зависимость связывания от концентрации лиганда.

7. Глобулярные и фибриллярные белки. Пространственные конфигурации (α-кератиновая, β-кератиновая) фибриллярных белков, их свойства.

8. Общая характеристика физико-химических свойств белков. Растворимость и осаждаемость белков. Факторы стабилизации белковой молекулы в растворах.

9. Высаливание белков. Высаливающие агенты. Механизм высаливания. Практическое использование высаливания.

10. Денатурация белков. Факторы, механизм, практическое использование денатурации белков.

11. Электрические свойства белков. Механизм возникновения электрического заряда белков. Изоэлектрическая точка. Электрофоретическое разделение белков сыворотки крови на бумаге, протеинограмма здорового человека.

12. Количественные методы определения белка. Определение белка крови биуретовым методом. Нормальное содержание белка крови. Гипо-, гиперпротсинемия. Белковый коэффициент крови.

13. Принципиальная схема устройства и работа фотоэлектроколориметра (ФЭК). Способ определения концентрации веществ с помощью калибровочного графика.

14. Принцип метода диализа, его практическое значение.

15. Классификация белков. Простые белки: общая характеристика альбуминов, глобулинов, гистонов, протаминов и глутелинов.

16. Сложные белки, общая характеристика, классификация..

17. Нуклеопротеины – строение, классификация, биологическая роль. Уровни упаковки ДНК в составе хроматина. Строение простетической группы нуклеопроетинов – понятие о нуклеиновых кислотах, отличия ДНК от РНК.

18. Собственно гликопротеины. Классификация. Характеристика простетической группы гликопротеинов – классификация, структура, химические свойства углеводов. Гликопротеины слизей.

19. Гликопротеины плазмы крови. Методы их исследования. Биологическая роль отдельных представителей (трансферрин, гаптоглобин, церрулоплазмин, транскортин, урогликопротеиды и др.).

20. Протеогликаны. Строение простетической группы – гликозаминогликанов. Принцип построения протеогликановых комплексов, цементирующая роль гиалуронвой кислоты.

21. Понятие о мукополисахаридозах или болезнях накопления гликозаминогликанов в тканях.

22. Хромопротеины, Общая характеристика железосодержащих хромопротеинов.

23. Строение гемоглобина. Формы гемоглобина (Нb А, Нb Р, Hb F, Hb S). Понятие о гемоглобинопатиях.

24. Производные гемоглобина. Схема строения окси-, карб-, карбокси- и мет-гемоглобина. Условия образования гемоглобина. Помощь при отравлении угарным газом и метгемоглобинемии.

25. Липопротеины. Общая их характеристика. Биологическая роль.

26. Липопротеины сыворотки крови. Строение. Методы разделения. Характеристики отдельных фракций (хиломикроны, ЛПОНП, ЛПНП, ЛПВП). Аполипопротеины.

27. Строение и свойства биологических мембран (криссталичность, жидкостность, ассиметричность, текучесть). Типы переноса веществ через биомембраны.

28. Липосомы, как модельная система биомембран, их применение в медицине.

29. Что такое ферменты? История развития учения о ферментах.

30. Общие свойства ферментов. Какие опыты позволяют их обнаружить. Сходства и отличия ферментов и неорганических катализаторов.

31. Химическая природа ферментов. Ферменты-протеиды и ферменты-протеины. Что такое кофактор, апофермент, холофермент, активный и аллостерический центры.

32. Химическая природа кофакторов и коферментов.

33. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры, рН, концентрации фермента, графическое изображение зависимости. Термостабильные и термолабильные ферменты.

34. Константа Михаэлиса, ее вывод и физический смысл.

35. Зависимость ферментной реакции от концентрации субстрата. Уравнение Михаэлиса-Ментен. График зависимости. Анализ уравнения Михаэлиса-Ментена. (различные соотношения S м Км). Уравнение Лайнуивера-Берка его графическое выражение.

36. Активаторы ферментов, типы их действия.

37. Ингибиторы ферментов. Специфические и неспецифические, обратимое и необратимое, конкурентное и неконкурентное, ингибирование.

38. Механизм действия ферментов. Влияние ферментов на энергию активации реакции. Механизм действия холинэстеразы.

39. Номенклатура и классификация ферментов. Характеристика отдельных классов и подклассов ферментов. Цифровой шифр ферментов.

40. Единицы выражения активности ферментов.

41. Изоферменты. Значение определения изоферментов в медицинской практике. Изоферменты лактатдегидрогеназы, креатинфосфатазы, щелочной фосфатазы.

42. Понятие о мультиферментных комплексах.

43. Энзимодиагностика различных заболеваний.

44. Понятие и примеры энзимопатий.

45. Понятие о энзимотерапии в медицинской практике.

46. Иммобилизованные ферменты (ИФ). Понятие об инженерной энзимологии. Применение ИФ в промышленности, медицине иммуноферментный анализ.

Графологическая структура модуля «Белки. Ферменты» (см. приложение 2).
1   ...   7   8   9   10   11   12   13   14   ...   40

Похожие:

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение...
Настоящие методические указания составлены в соответствии с Федеральным государственным образовательным стандартом впо и примерной...

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconУчебно-методический комплекс по дисциплине «Идентификация и фальсификация...
Перышкина Н. А. Идентификация и фальсификация продовольственных товаров. Учебно-методический комплекс. – Уфа: уи (ф) ргтэу, 2009....

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconОбщие методические указания по выполнению и защите курсовых работ...
Методическое руководство к выполнению курсовой работы выполнено в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта...

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconОдобрено учебно-методическим советом юридического факультета финансовое...
Учебно-методический комплекс по финансовому праву составлен в соответствии с требованиями Государственного образовательного стандарта...

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconУчебное пособие. М.: Право и Закон, 1997. 320 с. Isbn
Учебное пособие подготовлено выдающимся российским психологом-правоведом профессором Юрием Валентиновичем Чуфаровским в соответствии...

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconУчебное пособие для студентов высших учебных заведений подготовлено...
...

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconРоссийской Федерации Федеральное агентство по образованию Государственное...
Учебно-методический комплекс составлен в соответствии с Государственным образовательным стандартом высшего профессионального образования...

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconЮридическая психология. Учебное пособие
Учебное пособие подготовлено выдающимся российским психологом-правоведом профессором Юрием Валентиновичем Чуфаровским в соответствии...

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconРабочая программа по истории россии, XX
Рабочая программа курса истории России для 11-х классов составлена в соответствии с Федеральной примерной программой в рамках нового...

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconУчебно-методическое пособие подготовлено в соответствии с программой...
Утверждено редакционно-издательским советом академии в качестве учебного пособия для студентов 3-го курса факультета заочного обучения...

Вы можете разместить ссылку на наш сайт:
Школьные материалы


При копировании материала укажите ссылку © 2013
контакты
zadocs.ru
Главная страница

Разработка сайта — Веб студия Адаманов