Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия»




НазваниеРуководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия»
страница5/40
Дата публикации18.08.2013
Размер4.46 Mb.
ТипРуководство
zadocs.ru > Химия > Руководство
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   40

^ Примерный расчет. Между 2-ой и 3-ей минутами белое кольцо образовалось в 5-ой пробирке, где разведение мочи 1:16.

Следовательно, концентрация белка в исходной порции мочи равна:

0,0033% × 16 = 0,05%
УИРС. Качественное и количественное исследование мочи на содержание белка. Сравнение результатов количественного определения белка в моче сульфосалициловым методом и методом Брандберга-Робертса-Стольникова.

  1. Доказать наличие белка в моче с помощью проб, основанных на коагуляции белка химическими реактивами: пробой Геллера (см. выше) и с помощью р-ра сульфосалициловой кислоты (ССК).

^ Сульфосалициловая проба. Условия опыта. Моча должна быть кислой (рН5,0-6,5). Щелочную мочу подкисляют 10% р-ром уксусной кислоты. Излишек кислоты, как и щелочная реакция, приводят к ложноотрицательной пробе (объяснить механизм). К 2-3 мл мочи добавляют 4-6 капель 20% р-ра сульфосалициловой кислоты. При наличии белка моча мутнеет.

  1. ^ Сульфосалициловый метод количественного определения белка в моче. Ход работы. В пробирку вносят 5 мл 3% р-ра ССК и добавляют 1,25мл профильтрованной мочи, смешивают. Через 5 мин колориметрируют при длине волны 590-650 нм (оранжевый или красный светофильтр) против контроля в кювете на 5 мм. Контроль содержит 5мл 0,9% р-ра хлорида натрия. Интенсивность помутнения при коагуляции белка ССК пропорциональна его концентрации.

По калибровочному графику находят содержание белка в моче.

  1. Определить содержание белка в том же материале с помощью метода Брандберга-Робертса-Стольникова, как описано выше. Сравнить полученные результаты. Сделать вывод.


Эталоны ответов к тестовым заданиям

Вид 1. 1.1. А. –б; 1.1. Б. – а.

1.2. – г (включение пролина вызывает изгиб полипептидной цепи, делая невозможным вращение вокруг связи между a-углеродным атомом и азотом иминогруппы);

1.3. – в (гидрофобные радикалы прячутся внутри частицы белка);

1.4. – а (рIасп+ рIлиз/2).

Вид 2. 2.1. – 1-а, 2-б, 3-в, 4-г; 5-е, 6-ж, 7-д; 2.2. - 1-г, 2-в, 3-б, 4-а.

Вид 3. 3.1. - 4; 3.2. –4; 3.3. – 4; 3.4. – 2,4.

Вид 4. 4.1. –Д (-, +, -), 4.2 –Е (-, -, -), 4.3 – С (+, -, -).
Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1. Аминокислотный состав пептида отличается высоким содержанием диаминомонокарбоновых кислот – лизина и аргинина, в то же время, в структуре пептида отсутствуют ароматические и гетероциклические аминокислоты - фенилаланин, тирозин, гистидин и триптофан, дающие положительную ксантопротеиновую реакцию. В частности, тирозин с концентрированной азотной кислотой реагирует по следующей схеме:

желтая окраска


оранжевая окраска
Задача 2. В сильнокислой и щелочной среде осаждению белков препятствует заряд (отрицательный в кислой и положительный в щелочной). Поэтому, если рН исследуемой мочи не соответствует слабокислой реакции, можно получить ложно отрицательный результат.
Задача 3. В живой клетке процесс укладки синтезируемой полипептидной цепи - фолдинг регулируется особыми белками шаперонами. Эти белки контролируют формирование стабильной и биологически активной конформации, предотвращая образование из полипептидной цепи неспецифических клубков и агрегатов, а также участвуют в доставке белков к субклеточным мишеням.

^ Занятие № 3. Методы выделения и очистки белков.

Цель занятия. Освоить некоторые методы выделения и очистки белков, используемые в препаративной биохимии и лабораторной медицине. В результате освоения темы студент должен ознакомиться с методом электрофоретического разделения белков и научиться анализировать протеинограмму.


Студент должен

знать:

уметь:

-физико-химические свойства белков;

-методы фракционирования белков;

-методы очистки белков от низкомолеклярных примесей.

-анализировать протеинограмму;

-производить очистку белка от низкомолекулярных примесей методом гель-фильтрации и диализа.


^ Содержание занятия: студентам предстоит ответить на вопросы тест-контроля и вопросы преподавателя; ознакомиться с методами электрофореза белка на бумаге, очистки раствора белка от низкомолекулярных примесей методом диализа и гельфильтрации на молселекте, проанализировать полученные данные и сделать выводы.
^ УИРС - решение ситуационных задач, обсуждение рефератов.



Методические указания к самоподготовке

Методы препаративной химии белков основаны на их физико-химических свойствах, поэтому при подготовке к занятию следует повторить физико-химические свойства белков. Особое внимание следует уделить коллоидным свойствам белков, таким понятиям как амфотерность аминокислот и белков, зависимость электрических свойств белков от аминокислотного состава и свойствам белков в изоэлектрическом состоянии. Для лучшего усвоения материала занятия, используя учебник, лекции и дополнительную литературу, выполните следующие задания.



№№

Задание

Указания к выполнению задания

1

2

3

1.

Изучите методы выделения индивидуальных белков.

1. Перечислите методы фракционирования белков, позволяющие получить индивидуальный белок.

2. Кратко сформулируйте, на каких физико-химических свойствах основаны перечисленные методы.

2.

Изучите, почему белки обладают свойствами коллоидов.

1.Выпишите способы определения молекулярной массы белков.

2.Перечислите данные, подтверждающие высокую молекулярную массу белков.

3.Чем можете подтвердить способность белков образовывать коллоидные растворы?

5.Охарактеризуйте принцип метода диализа. Какое практическое значение имеет диализ?

3.

Вспомните электрические свойства белков.

1. Вспомните механизм возникновения электрического заряда. Что такое изоэлектрическая точка?

2.Охарактеризуйте явление электрофореза белков. Запомните виды электрофореза.

3.Укажите факторы, от которых зависит скорость перемещения белковых молекул в поле постоянного электрического тока.

4. Напишите, на какие фракции разделяют белки сыворотки крови при электрофорезе на бумаге. Выпишите протеинограмму – соотношение белковых фракций - здорового ребенка и взрослого человека.

5. Изучите возможности электрофоретического разделения белков на полиакриламидном геле, принцип диск-электрофореза и его значение для разделения белков сыворотки крови.

4.

Повторите растворимость белков.

1. Выясните, чем определяется растворимость белков, и какие факторы стабилизируют белковую молекулу в растворе.

5.

Изучите метод хроматографии белков.

1.Выпишите классификацию методов хроматографического разделения белков по механизму разделения и технике проведения. Сформулируйте принцип метода адсорбционной, ионнообменной, афинной, и распределительной хроматографии. Кратко опишите процедуру гель-фильтрации и газожидкостной хроматографии.


Подготовьте к предстоящему занятию протокол, в котором отразите принцип метода и ход работы. Не забудьте оставить достаточно места для выводов после выполнения каждой работы.
Графологическая структура «Выделение и очистка белков»


Примеры тестов контроля исходного уровня знаний

Вид 1. Выберите наиболее правильный ответ.

1.1. Молекулярная масса большинства белков находится в пределах … .

а) от 6000 до 10000000 и выше

в) свыше 50000

б) от 30000 и выше

г) свыше100000
1.2. Глутаминовая кислота при рН 10 находится в виде иона … .

в)

б) г)
1.3. Смесь аминокислот, содержащая аспартат (pI 3,0) и лизин (рI 9,7), разделяется методом ионообменной хроматографии. В каком порядке будут выходить аминокислоты из колонки, заполненной триметиламинополистерольной смолой, имеющей положительно заряженные группы (анионообменник) при рН 7?

а) асп, лиз

б) лиз, асп
1.4. Детергенты (тритон Х-100, додецилсульфат натрия) при экстракции белков к среде извлечения добавляют для … .

а) повышения устойчивости белков к денатурации

б) перевода белков в изоэлектрическое состояние

в) разрушения белково-липидных комплексов
1.5.Оптическое явление, доказывающее коллоидные свойства белков,- это … .

а) явление светорассеивания – конус Тиндаля

б) вращение плоскости поляризованного света

в) интенсивное светопоглощение при длине волны 280 нм
Вид 2. Установите соответствие.

2.1. Классифицируйте приведенные ионообменные смолы в зависимости от заряда функциональных групп.

1. триметиламинополистирол а. катионообменник

2. диэтиламиноэтилцеллюлоза б. анионообменник

3. карбоксиметилцеллюлоза

4. сульфонированные полистиролы
2.2. В каком направлении будут двигаться в электрическом поле следующие белки при рН 6,3?

1. овальбумин (ИЭТ 4,6) а) останется на старте

2. β-лактоглобулин (ИЭТ 6,3) б) движется к катоду

3. химотрипсин (ИЭТ 9,5) в) движется к аноду
Вид 3. Правильное сочетание ответов.

3.1. Смесь аминокислот, содержащая:

1) глицин

2) аланин

3) лизин

4) глутаминовую кислоту

5) аргинин

подвергли электрофорезу на бумаге при pH=6.

Какие аминокислоты будут двигаться при этом условии к «аноду»?
3.2. Метод разделения белков, основанный на различии размера белковых молекул -

  1. кристаллизация

  2. диализ

  3. ионообменная хроматография

  4. гель-фильтрация

  5. изоэлектрическое фокусирование


3.3. Электрофоретическая процедура, не зависящая от заряда белка -

1. диск-электрофорез

2. зональный электрофорез

3. изоэлектрическое фокусирование

4. электрофорез в полиакриламидном геле с добавлением детергента (натрия додецилсультата)

5. электрофорез на бумаге
Вид 4. Определите правильность утверждений и связь между ними.

4.1. Очистить раствор белка от низкомолекулярных примесей можно методом гель-фильтрации на сефадексе, потому что с помощью этого метода можно разделить вещества с разной молекулярной массой.

4.2. По степени дисперсности растворы белков являются истинными растворами, а по свойствам – коллоидными, так как белки являются высокомолекулярными соединениями.
Примеры ситуационных задач

Задача 1. При электрофорезе на бумаге белков сыворотки крови больного Р.С. получили следующие результаты: альбумины-48,5%, α1-глобулины-12,6%, α2-глобулины-7,3%, β-глобулины-14,8%, γ-глобулины-16,8%. Выделите изменения, обнаруженные в белковом спектре крови больного и рассчитайте величину белкового коэффициента, если общее содержание белка в крови у данного больного составляло 62 г/л.
Задача 2. Необходимо разделить смесь белков, содержащую церрулоплазмин (Mr 151000, ИЭТ 4,4), β-лактоглобуллин (молекулярная масса 150000, ИЭТ 6,3) и γ-глобулин (молекулярная масса 37100, ИЭТ 5,2). Предложите методы разделения смеси этих белков. В какой последовательности будут выделяться эти белки из смеси?
^ Самостоятельная работа студентов

Работа № 1. Разделение и количественное определение белковых

фракций сыворотки крови методом электрофореза на бумаге.

Принцип метода. Электрофорез – это движение заряженных частиц в поле постоянного электрического тока. Скорость перемещения молекул белков в электрическом поле зависит от величин заряда, молекулярной массы, pH, ионной силы раствора.

Белки сыворотки крови помещают на полоску бумаги, смоченную буферным раствором, через которую пропускают постоянный электрический ток. При pH 8,6 белки сыворотки крови заряжаются отрицательно и под воздействием электрического поля перемещаются к аноду.

Сыворотка крови человека содержит различные белки. С помощью электрофореза на бумаге выделяются 5 фракций - альбумины, α1-, α2-, β-, γ-глобулины.

^ Клинико-диагностическое значение. Многие патологические состояния сопровождаются количественными изменениями соотношения белковых фракций крови – диспротеинемиями. Уменьшение содержания фракции альбуминов характерно для заболеваний печени за счет снижения белок-синтезирующей функции гепатоцитов. Гипоальбуминемия также сопровождает заболевания почек вследствие потери белка с мочой. Увеличение содержания фракций α1- и α2-глобулинов наблюдается при стрессе, наличии воспалительных процессов за счет белков «острой фазы», при коллагенозах и метастазировании злокачественных новообразований. Фракция β-глобулинов растет при гиперлипопротеинемиях. Фракция γ-глобулинов повышается при иммунных реакциях, вызванных вирусными и бактериальными инфекциями. Снижение γ-глобулиновой фракции может иметь место при первичном и вторичном иммунодефиците.

^ Порядок выполнения работы

1. Устройство прибора для электрофореза. Прибор состоит из выпрямителя, подающего постоянный ток необходимого напряжения, и камеры для электрофореза. Сама камера состоит из 2-х ванн; в одной из них имеется неподвижная перегородка, куда помещается платиновый электрод (+ анод), а в другой находится электрод из нержавеющей стали (- катод). Между ваннами, заполненными соответствующим буфером, имеется соединительный мост, на который помещают полоски специальной фильтровальной бумаги.

^ 2. Проведение электрофореза. Заполнить обе ванны камеры раствором вероналового буфера с pH 8,6. Буферного раствора в ваннах должно быть столько, чтобы он покрывал неподвижную перегородку, но был ниже подвижных перегородок.

Вставить в ванны электроды. Вырезать из фильтровальной бумаги полосы необходимого размера в зависимости от величины камеры (обычно шириной 4-6 см) и простым карандашом отметить место, на которое впоследствии будет наноситься сыворотка (старт). Смочить эти полоски в вероналовом буфере. Вставить в ванны-камеры соединительный мост. Поместить полоски бумаги на сухие пластинки щипцами, погрузив концы полосок в ванны с буфером, и на заранее отмеченные участки бумаги нанести сыворотку по 0,025-0,005 мл на расстоянии 5-6 см от края моста. Нанесение сыворотки производится со стороны катода.



Рисунок 1. Схема камеры для электрофореза белков на бумаге:

1-стабилизатор; 2-камера для электрофореза; 3-буферный раствор; 4-поддерживающий соединительный мост-электрод; 5-фильтровальная бумага для электрофореза.

После нанесения на бумажные полоски сыворотки камера герметично закрывается крышкой. На крышке камеры расположен прижим блокировки, служащий для включения камеры. Присоединенный выпрямитель подает к камере постоянный ток от 2 до 4 мА при постоянном напряжении 110-160В. Электрофорез проводят при градиенте потенциала от 3 до 8 В на 1 см полосы при комнатной температуре. Хорошее разделение происходит за 18-20 часов.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   40

Похожие:

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение...
Настоящие методические указания составлены в соответствии с Федеральным государственным образовательным стандартом впо и примерной...

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconУчебно-методический комплекс по дисциплине «Идентификация и фальсификация...
Перышкина Н. А. Идентификация и фальсификация продовольственных товаров. Учебно-методический комплекс. – Уфа: уи (ф) ргтэу, 2009....

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconОбщие методические указания по выполнению и защите курсовых работ...
Методическое руководство к выполнению курсовой работы выполнено в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта...

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconОдобрено учебно-методическим советом юридического факультета финансовое...
Учебно-методический комплекс по финансовому праву составлен в соответствии с требованиями Государственного образовательного стандарта...

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconУчебное пособие. М.: Право и Закон, 1997. 320 с. Isbn
Учебное пособие подготовлено выдающимся российским психологом-правоведом профессором Юрием Валентиновичем Чуфаровским в соответствии...

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconУчебное пособие для студентов высших учебных заведений подготовлено...
...

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconРоссийской Федерации Федеральное агентство по образованию Государственное...
Учебно-методический комплекс составлен в соответствии с Государственным образовательным стандартом высшего профессионального образования...

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconЮридическая психология. Учебное пособие
Учебное пособие подготовлено выдающимся российским психологом-правоведом профессором Юрием Валентиновичем Чуфаровским в соответствии...

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconРабочая программа по истории россии, XX
Рабочая программа курса истории России для 11-х классов составлена в соответствии с Федеральной примерной программой в рамках нового...

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconУчебно-методическое пособие подготовлено в соответствии с программой...
Утверждено редакционно-издательским советом академии в качестве учебного пособия для студентов 3-го курса факультета заочного обучения...

Вы можете разместить ссылку на наш сайт:
Школьные материалы


При копировании материала укажите ссылку © 2013
контакты
zadocs.ru
Главная страница

Разработка сайта — Веб студия Адаманов