Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия»




НазваниеРуководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия»
страница6/40
Дата публикации18.08.2013
Размер4.46 Mb.
ТипРуководство
zadocs.ru > Химия > Руководство
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   40

^ 3. Выключение прибора и выявление белковых фракций. Выключают прибор. Снимают камеры и извлекают бумажные полоски из прибора. Затем каждую полоску помещают в сушильный шкаф на 20 минут при температуре 1050С. При этом происходит фиксация белковых фракций на бумаге. Окраску белков проводят раствором бромфенолового-синего в течение 30 минут, затем промывают электрофореграммы 2% раствором уксусной кислоты. Полученные электрофореграммы сушат на воздухе. Белковые фракции окрашиваются в сине-зеленый цвет.

^ 4. Количественное определение белковых фракций. Окрашенные белковые пятна вырезают, краситель элюируют 0,01 н раствором щелочи. Интенсивность окраски каждой фракции определяют колориметрически на ФЭКе.

Количественное определение белковых фракций на электрофореграмме можно установить двумя способами: путем элюирования краски и фотоколориметрирования и денситометрическим методом.

Содержание белковых фракций сыворотки крови, полученное с помощью электрофореза на бумаге, в среднем составляет у взрослого человека:

альбумины 55,4-65,9 %

α1-глобулины 3,4-4,7 %

α2-глобулины 5,5-9,5 %

β-гдобулины 8,9-12,6 %

γ-глобулины 13-22,2 %

^ Денситометрический метод. В специальном аппарате (денситометре) через электрофореграмму пропускают пучок света, поглощение которого зависит от оптической плотности окрашенных белковых пятен. Свет, прошедший через электрофореграмму, улавливается фотоэлементом и превращается в электрический ток, колебания которого фиксируют на бумажном листе в виде кривой, каждый пик кривой соответствует определенной белковой фракции.


Рисунок 2. Электрофореграмма сыворотки человека.
Работа № 2. Очистка белков от низкомолекулярных примесей методом диализа.

Принцип метода основан на неспособности молекул белка (коллоидных частиц) проникать через полупроницаемую мембрану (пергамент, целлофан, колодий и др.), в то время как низкомолекулярные примеси легко проходят через поры этих мембран. Метод диализа широко используется для разделения и очистки белков и других биополимеров от примесей солей и низкомолекулярных органических соединений. Основанный на этом же принципе метод гемодиализа (вивидиффузия), применяется для лечения больных с почечной недостаточностью (аппарат «искусственная почка»).

^ Ход работы. В подготовленный колодиевый или целлофановый мешочек поместить 1 мл сыворотки крови (раствора яичного белка) и 3-4 мл 6% раствора хлористого натрия, аккуратно поместить их в стакан с дистиллированной водой. Через 30-60 минут с небольшими порциями диализируемого раствора белка (содержимое мешочка) и диализата (наружная жидкость) провести пробы на хлориды и белок, чтоб удостовериться в том, что соль диффундировала, а белок остался в мешочке.

Для обнаружения белка провести биуретовую реакцию.

^ Принцип метода. Реакция основана на способности пептидной группы белков и полипептидов образовывать с ионами меди в щелочной среде комплексные соединения фиолетового цвета. Реакция позволяет обнаружить наличие пептидной связи в исследуемом веществе и, следовательно, является универсальной реакцией для обнаружения веществ белковой природы. Свое название реакция получила от производного мочевины биурета, который дает в данных условиях то же окрашивание, что и белок.

^ Техника проведения работы. В пробирку добавить 5 капель раствора белка, 10 капель раствора едкого натра и 1 каплю раствора сульфата меди. Отметить появление красно-фиолетового окрашивания.

Для обнаружения хлоридов к 0,5-1 мл раствора добавить 1-2 капли 1% раствора азотной кислоты и 1-2 капли 1% раствора азотнокислого серебра и отметить выпадение творожистого осадка.

^ Работа № 3. Очистка от низкомолекулярных примесей методом гельфильтрации на сефадексе (молселекте).

Основным свойством декстранового геля, как хроматографического материала, является способность разделять вещества согласно размерам молекул. Крупные молекулы при хроматографии не проникают в частицы геля и элюируются в свободном объеме, т.е. в свободном пространстве между частицами геля. Применяя сефадексы (молселекты) разных типов с разными размерами частиц и изменяя условия хроматографии; гель-фильтрацию на сефадексах (молселектах) можно использовать для разделения смесей в зависимости от молекулярной массы, для определения чистоты веществ, а также в целях обессоливания и концентрирования растворов высокомолекулярных соединений и др.

Расчеты показывают, что на сефадексе Г-25 (молселекте Г-25) молекулы массой 5600 уже будут элюировать в свободном объеме, а соли и органические вещества с молекулярной массой в пределах 1000 проникают в частицы декстранового геля, обладая коэффициентом распределения 0,7-1,0. Это позволяет сравнительно легко отделить с помощью сефадекса Г-25 (молселекта Г-25) соли и низкомолекулярные органические примеси из растворов белков и других молекул.
Р
исунок 3. Схема устройства для гель-фильтрации.

1-колонка; 2-пробирка со стеклянной трубкой; 3-капельница, содержащая элюирующий раствор; 4-зажим; 5-кружок фильтровальной бумаги; 6-поверхность суспензии геля; 7-изотонический раствор NaCl; 8-смесь фракционируемых веществ.

⌂-вода; •-Hb; +-изотонический раствор NaCl; о-молселект.
^ Ход работы. Предварительно производят подготовку сефадекса (молселекта) и наполняют колонку. Для этого около 50 г сефадекса Г-25 (молселекта Г-25), достаточного для заполнения 7-8 колонок, необходимо суспендировать в стакане 0,1% растворе хлористого натрия (около 400 мл) и оставить для набухания на двое суток. Затем раствор соли из стакана слить, залить дистиллированной водой, суспензию сефадекса (молселекта) взболтать, дать осесть основной массе геля, а воду с неосевшими частицами слить. Отделение мелких частиц сефадекса повторить 4-5 раз.

Колонку размеров 2x10 см закрепить в штативе в строго вертикальном положении, на дно колонки поместить диск из плексигласа с отверстием и сверху на него опустить кружок фильтровальной бумаги. Колонку на 2/3 объема заполнить водой и в остальную часть постепенно вливать суспензию сефадекса высотой 2-3 см, начать медленно профильтровывать воду, продолжая добавление сефадекса. После образования слоя геля 5-6 см наполнение колонки прекратить, колонку закрыть и над слоем сефадекса поместить кружок фильтровальной бумаги. При наполнении колонки следить, чтобы в колонке не оставалось пузырьков воздуха, и над гелем был слой жидкости.

Для проведения работы открыть подготовленную колонку, дать профильтроваться воде над слоем геля и наслоить пипеткой 1-1,5 мл 2% раствора гемоглобина или другого окрашенного белка с равным объемом 3% раствора хлористого натрия. Как только раствор профильтруется (войдет в гель), ополоснуть стенки колонки небольшим количеством дистиллированной воды и начать элюирование дистиллированной водой со скоростью тока примерно 0,5 мл в минуту. Элюаты объемом 2,5-3 мл собирать в отдельные пробирки. Через 12-15 минут элюирование прекратить, в исходном растворе белка и в отдельных фракциях элюата проверить наличие белка по окраске содержимого пробирок и наличие хлоридов реакцией с азотнокислым серебром (см. выполнение предыдущей работы).
Эталоны ответов к тестовым заданиям

Вид 1.

1.1. -а;

1.2. -б;

1.3. –б (аминокислота, имеющая наибольший отрицательный заряд прочнее удерживается положительно заряженными частицами смолы);

1.4. -в;

1.5. –а.

Вид 2.

2.1. 1,2 –б; 3,4 –а;

2.2. 1-в; 2-а; 3-б.

Вид 3.

3.1.–4;

3.2. –4;

3.3 -4 (детергент устраняет влияние заряда белка и разделение полностью определяется размером белковых молекул).

Вид 4. 4.1.- В (+, +, +); 4.2. – А (+, +, +).
Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1. Снизилось процентное содержание альбуминов (в норме альбумины составляют 55,4-78,9%), повысилось содержание α1- и β-глобулинов. Белковый коэффициент снижен и составляет 0,93. Альбуминов в сыворотке крови больного содержится 30 г/л, глобулинов – 32 г/л.
Задача 2. Для отделения β-лактоглобулина, значительно отличающегося по величине молекулярной массы, можно использовать метод гель-фильтрации. Для разделения церрулоплазмина и γ-глобулина, имеющих различные значения ИЭТ, целесообразно использовать электрофорез.

^ Занятие № 4. Сложные белки. Биологические мембраны.

Цель занятия. Ознакомиться и закрепить у студентов знания о структуре и биологической роли сложных белков нуклео-, глико-, хромо-, липо- и фосфопротеинов. Изучить структуру и свойства биологических мембран.


Студент должен

знать:

уметь:

-строение отдельных представителей сложных белков - глико-, хромо-, нуклео-, фосфо-, липопротеинов;

-биологическую роль гликопротеинов сыворотки крови и слизистых оболочек;

-структуру и биологические функции ДНК и РНК;

-основные формы и производные гемоглобина;

-состав и функции липопротеинов сыворотки крови;

-строение и функции биомембран;

типы переноса веществ через мембраны.

-представить схематически первичную и вторичную структуры РНК и ДНК;

-схематически представит структуру гема, охарактеризовать связи гема и глобина;

-интерпретировать изменения количества липопротеинов в сыворотке крови.


^ Содержание занятия. На занятии студенту предстоит пройти проверку выполнения домашнего задания, ответить на вопросы преподавателя, пройти тест-контроль. В ходе практикума студенты выделят муцин из слюны и определят в нем углеводный компонент, также им предстоит выделить казеиноген из молока и доказать наличие в его составе фосфорной кислоты, провести качественную реакцию на гемоглобин и определить содержание липопротеинов низкой плотности в сыворотке крови.
^ УИРС. Решение ситуационных задач, обсуждение реферативных сообщений.
Методические указания к самоподготовке

Для успешного овладения материала по сложным белкам необходимо иметь четкие представления о структуре их простетической группы, поэтому при подготовке к занятию необходимо вспомнить строение углеводов, липидов, нуклеотидов и нуклеиновых кислот, порфиринов. Пользуясь учебником и лекциями, изучите классификацию гликопротеинов, характер связи между белковыми и углеводными компонентами, структуры и свойства отдельных представителей гликопротеинов.

При подготовке к занятию обратите внимание на роль фосфопротеинов, на значение для организма человека казеина молока, альбумина и вителлина яичного желтка, ихтуллина рыбьей икры, разберите биологическое значение нуклео-, хромо-, липопротеинов в организме человека, изучите строение биомембран.

Для усвоения темы выполнить следующие задания.


№№

Задание

Указания к выполнению задания

1

2

3

1.

Вспомните классификацию, структуру и химические свойства углеводов.

1) Напишите формулы (по Хеуорзсу), α-D-глюкозы, α-D-фруктозы, N-ацетилглюкозамина, нейраминовой кислоты.


2.

Изучите строение, свойства и биологическую роль отдельных групп гликопротеинов.

1) Обратите внимание на О- и N-гликозидные связи между белковым и углеводными компонентами гликопротеинов.

2) Приведите примеры гликопротеинов, обладающих ферментативными свойствами, являющихся гормонами, белками свертывания крови, транспортными белками.

3) Кратко охарактеризуйте свойства и биологическую роль гликопротеинов слизей: муцина слюны, гастро-, урогликопротеинов.

3.

Изучите классификацию, структуру и биологическую роль протеогликанов.

1) Приведите классификацию гликозаминогликанов. Напишите строение дисахаридных звеньев гиалуроновой кислоты, хондроэтин-, кератан-, дерматан-, гепарансульфата.

2) Зарисуйте схему протеогликановых комплексов внеклеточной жидкости. Охарактеризуйте роль гиалуроновой кислоты как цементирующего агента межклеточного матрикса.

3) Перечислите физико-химические свойства протеогликановых комплексов.

4.

Вспомните структуру азотистых оснований, нуклеозидов и нуклеотидов. Как образуется полинуклеотидная цепь ДНК и РНК?

1) Напишите фрагмент ДНК состава ТАГ.

2) Напишите фрагмент РНК состава ЦУА.

5.

Вспомните вторичную структуру ДНК и изучите уровни укладки ДНК в составе ДНК-протеинов.

1) Нарисуйте двойную спираль ДНК и приведите ее характеристики - диаметр, количество нуклеотидных пар в витке. Как образуются малая и большая борозды ДНК? Покажите комплементарное взаимодействие (образование водородных связей) между аденином и тимином, гуанином и цитозином

3) Как образуются нуклеосомы, что такое соленоиды? Разберите пространственную укладку молекулы ДНК в хромосомах в клубки второго, третьего порядков.

4) Охарактеризуйте биологическую роль гистонов в ДНК-протеинах.

6.

Вспомните строение различных видов РНК и изучите структуру РНК-протеинов.

1) Охарактеризуйте вторичную и третичную структуру РНК.

2) В чем заключаются особенности рибосомальной РНК? Зарисуйте строение рибосом и охарактеризуйте каждую субчастицу как рибонуклеопротеин.

3) Схематически представьте строение транспортной РНК и выделите особенности ее строения и биологическую роль.

7.

Изучите структуру гемоглобина.

1) Напишите химическую формулу гема.

2) Как соединяются молекулы гема с полипептидными цепями глобина в молекуле гемоглобина?

4) Схематически представьте четвертичную структуру гемоглобина.

8.

Изучите свойства производных гемоглобина и их строение.

1) Схематически покажите как присоединяются лиганды к молекуле гемоглобина – как образуются окси-, карбокси-, карбгемоглобин.

2) Как оказать первую помощь при отравлении CO?

3) Что такое метгемоглобин? Опишите группы соединений, лекарственных веществ, приводящие к метгемоглобинемии.

9.

Вспомните строение липидов.

1) Приведите классификацию липидов.

3) Приведите общую формулу триацилглицеринов, приведите примеры простого (триолеин) и смешанного (стреароолеопальмитин) тригицерида. Вспомните, какова зависимость физико-химических свойств нейтральных жиров от жирно-кислотного состава.

4) Вспомните строение фосфоглицеридов - фосфатидной кислоты, лецитинов, кефалинов, фосфатидилсеринов и плазмалогенов.

5) Вспомните строение сфинголипидов - церамидов, сфингомиелинов, цереброзидов и ганглиозидов.

6)Какие соединения относятся к группе стеринов? Вспомните строение холестерина и его эфиров.

10.

Изучите строение, состав, методы разделения и биологическую роль липопротеинов плазмы крови.

Зарисуйте строение липопротеина плазмы крови.

Какими методами можно произвести разделение плазменных липопротеинов?

Какова функция липопротеинов плазмы крови?

Заполните таблицу, характеризующую состав основных групп липопротеинов сыворотки крови.

11.

Изучите строение и функции биомембран

1) Укажите химический состав биомембран. Зарисуйте схему строения биомембран как липопротеинового би-слоя.

2) Охарактеризуйте фазовое состояние – жидкокристаллическую структуру биомембран и влияние соотношения холестерин: жирные кислоты на фазовые переходы.

3) Опишите виды транспорта через биомембраны.

4) Что такое липосомы? С какой целью они могут использоваться в медицине?

12.

Изучите строение фосфопротеинов

1) Охарактеризуйте связь фосфорной кислоты с белковой частью (апопротеином)

2) Приведите примеры наиболее распространенных фосфопротеинов и охарактеризуйте их биороль.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   40

Похожие:

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение...
Настоящие методические указания составлены в соответствии с Федеральным государственным образовательным стандартом впо и примерной...

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconУчебно-методический комплекс по дисциплине «Идентификация и фальсификация...
Перышкина Н. А. Идентификация и фальсификация продовольственных товаров. Учебно-методический комплекс. – Уфа: уи (ф) ргтэу, 2009....

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconОбщие методические указания по выполнению и защите курсовых работ...
Методическое руководство к выполнению курсовой работы выполнено в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта...

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconОдобрено учебно-методическим советом юридического факультета финансовое...
Учебно-методический комплекс по финансовому праву составлен в соответствии с требованиями Государственного образовательного стандарта...

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconУчебное пособие. М.: Право и Закон, 1997. 320 с. Isbn
Учебное пособие подготовлено выдающимся российским психологом-правоведом профессором Юрием Валентиновичем Чуфаровским в соответствии...

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconУчебное пособие для студентов высших учебных заведений подготовлено...
...

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconРоссийской Федерации Федеральное агентство по образованию Государственное...
Учебно-методический комплекс составлен в соответствии с Государственным образовательным стандартом высшего профессионального образования...

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconЮридическая психология. Учебное пособие
Учебное пособие подготовлено выдающимся российским психологом-правоведом профессором Юрием Валентиновичем Чуфаровским в соответствии...

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconРабочая программа по истории россии, XX
Рабочая программа курса истории России для 11-х классов составлена в соответствии с Федеральной примерной программой в рамках нового...

Руководство подготовлено в соответствии с примерной программой по дисциплине «Биологическая химия» iconУчебно-методическое пособие подготовлено в соответствии с программой...
Утверждено редакционно-издательским советом академии в качестве учебного пособия для студентов 3-го курса факультета заочного обучения...

Вы можете разместить ссылку на наш сайт:
Школьные материалы


При копировании материала укажите ссылку © 2013
контакты
zadocs.ru
Главная страница

Разработка сайта — Веб студия Адаманов