412 научная сессия общего собрания ран




Скачать 256.15 Kb.
Название412 научная сессия общего собрания ран
Дата публикации01.07.2013
Размер256.15 Kb.
ТипДокументы
zadocs.ru > Биология > Документы

412 НАУЧНАЯ СЕССИЯ ОБЩЕГО СОБРАНИЯ РАН



БИОЧИПЫ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ XXI ВЕКА

Академик А.Д. Мирзабеков

Биологические микрочипы являются одним из наиболее быстро развивающихся эксперимен­тальных направлений современной биологии. Су­ществует два основных типа биочипов [1]. Пер­вый тип, рассматриваемый в настоящей статье, -это микроматрицы различных соединений, глав­ным образом биополимеров, иммобилизованных на поверхности стекла, в микрокаплях геля, в ми­крокапиллярах. Другим типом биочипов являются миниатюризованные "микролаборатории". Эф­фективность биочипов обусловлена возможнос­тью параллельного проведения огромного коли­чества специфических реакций и взаимодействий молекул биополимеров, таких как ДНК, белки, по­лисахариды, друг с другом и низкомолекулярными лигандами. Удается в достаточно простых парал­лельных экспериментах собрать и обработать на отдельных элементах биочипа огромное количе­ство биологической информации. В этом заклю­чается фундаментальное информационное сход­ство биочипов с электронными микрочипами. Однако между ними имеется и ряд принципиаль­ных различий.

На рис. 1 показан принцип действия ячейки ДНК или олигонуклеотидного биочипа, основан-

ный на комплементарных взаимодействиях осно­вания аденина (А) с тимином (Т) и гуанина (G) с цитозином (С) в двух нитях ДНК. Если последова­тельность оснований в одной нити ДНК (или оли-гонуклеотида) полностью комплементарна по­следовательности другой нити, то образуется ста­бильная совершенная двухнитчатая спираль -дуплекс. Однако присутствие в дуплексе даже од­ной неправильной пары, например G-G, предот­вращает образование дуплекса. Если иммобили­зовать в одном из элементов микрочипа специфи­ческую одноцепочечную ДНК или, положим, 20-мерный олигонуклеотид (пробу), то при добав­лении к микрочипу меченных флюоресцентными красителями фрагментов ДНК, например генома человека, будет происходить их высокоспеци­фичное взаимодействие. Заданный олигонуклео-тидный элемент биочипа специфически свяжет только одну комплементарную последователь­ность из 420 = 1.09 х 1012 всех возможных последо­вательностей этой длины в ДНК. В результате флюоресцентное свечение наблюдается только на этом комплементарном элементе биочипа. Та­ким образом, один элемент биочипа производит одну выборку примерно из триллиона возмож-


ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК том 73

№ 5 2003

^ БИОЧИПЫ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ XXI ВЕКА







Рис. 1. Схема образования двойной спирали ДНК на биочипе

Олигонуклеотид фиксирован на одном из элементов биочипа и избирательно связывает из многих флуоресцентно меченых фраг­ментов ДНК только комплементарный. В результате только этот элемент начинает светиться. Это происходит благодаря высоко­специфичным взаимодействиям комплементарных пар нуклеотидов А с Т и G с С. Присутствие некомплементарной пары, например G-G, предотвращает взаимодействие и оставляет элемент микрочипа темным

ных вариантов, в отличие от элемента электрон­ного чипа, где происходит двоичная выборка: ДА или НЕТ.

Стремительное развитие биологии во второй половине прошлого века тесно связано с появле­нием молекулярной и клеточной биологии, кото­рая основана на концепции о редукционизме -сводимости сложных биологических процессов к процессам, протекающим на уровне отдельных молекул биополимеров, прежде всего белков и нуклеиновых кислот и их различных клеточных комплексов и структур. Редукционизму противо­поставлялась концепция интегратизма о необхо­димости комплексного изучения структуры и функционирования в клетке всей совокупности макромолекул. В последние годы появились та­кие новые интегративные подходы, как геноми-ка, протеомика и селломика, развиваемые боль­шими коллективами или часто целыми "научны­ми фабриками". Эти направления позволяют устанавливать структуру и изучать процессы на уровне генов всего генома, белков всей клетки или клеток всей ткани. Развиваемые в последние годы биологические микрочипы позволяют реа­лизовать в доступной форме весьма сложные ин­тегративные подходы геномики, протеомики и селломики. Например, олигонуклеотидные и ДНКовые микрочипы, выпускаемые рядом фирм, позволяют в достаточно простых, доступных от-

дельным исследователям экспериментах изучать экспрессию большинства генов различных бакте­рий и многих генов человека. На очереди созда­ние белковых чипов, содержащих большое коли­чество иммобилизованных клеточных белков или специфичных к ним антител.

Макроматрицы ДНК и белков иммобилизо­ванных на фильтре, или фиксированных в лунках планшет, были известны достаточно давно. Одна­ко первая работа по ДНКовым микрочипам [2] и одна из первых по белковым микрочипам [3] в со­временном формате были опубликованы нашей лабораторией в Институте молекулярной биоло­гии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ). Этот принципиальный скачок был предложен для ис­пользования в новом методе секвенирования ДНК гибридизацией. В 1968 г. Советский Союз, а вслед за ним США и другие страны приняли госу­дарственные программы установления полной последовательности всех 3 миллиардов нуклеоти­дов генома человека. Широко дискутировался во­прос, должна ли эта задача решаться масштаби­рованием существующих подходов или должны быть разработаны новые, более эффективные методы. В связи с временными ограничениями, ученые пошли по пути существенного улучшения и гигантского масштабирования уже существую­щего метода, основанного на считывании одного нуклеотида за другим с конца коротких фрагмен-


ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК том 73

№ 5 2003

414

^ НАУЧНАЯ СЕССИЯ ОБЩЕГО СОБРАНИЯ РАН








Рис. 2. Секвенирование фрагмента ДНК гибридизацией с полным олигонуклеотидным микрочипом, содержащим все 4096 6-меров

6-меры микрочипа, образующие при гибридизации с флуоресцентно меченым фрагментом ДНК совершенные дуплексы, интенсив­но светятся. Такие соседствующие 6-меры перекрываются на пять нуклеотидов; это перекрывание позволяет однозначно восстано­вить нуклеотидную последовательность ДНК

тов ДНК. Этот метод в химическом и фермента­тивном варианте был предложен В. Гилбертом и Ф. Сенгером, которые и разделили Нобелевскую премию за 1967 г. В развитии химического метода большую роль сыграли академики Е.Д. Свердлов и А.Д. Мирзабеков. В своей Нобелевской речи В. Гилберт отметил, что "идея метода пришла только после второго визита А. Мирзабекова" в его лабораторию [4].

В поисках новых подходов к секвенированию ДНК нами, а также независимо двумя другими

группами в Англии и Сербии было предложено в 1988 г секвенирование гибридизацией [5]. В этом методе секвенирование проводится не отдельны­ми нуклеотидами, а словами в составе полного "словаря" нуклеотидных слов определенной ве­личины. Такой словарь может содержать все возможные 4096 гексануклеотидов, т.е. шести-буквенных генетических слов. Для нас стала оче­видной необходимость создания микрочипов, и в следующем году появилась первая статья, описы­вающая приготовление и свойства предложенных


ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК том 73

№ 5 2003

^ БИОЧИПЫ В БИОЛОГИИ

И МЕДИЦИНЕ XXI ВЕКА

415


нами гелевых микрочипов [2]. Позднее нами бы­ли созданы полные микрочипные гексануклеотид-ные словари. С этого момента и по настоящее вре­мя наша группа сконцентрировалась на развитии биочипов: создании ДНКовых, белковых и кле­точных биочипов, на развитии технологий их про­изводства и на их применении в фундаментальных исследованиях и их различных приложениях в ме­дицине, биотехнологии и др. областях. Эти иссле­дования рассмотрены в обзорной работе [6].

Рис. 2 показывает такой полный 6-мерный олигонуклеотидный микрочип и секвенирование на нем 50-нуклеотидного фрагмента ДНК [7]. Для приведенного случая идентификация всех 6-меров, комплементарных к ДНК, и перекрыва­ние соседних 6-меров на пять нуклеотидов позво­ляет восстановить полную нуклеотидную после­довательность ДНК. В действительности метод в данном варианте работает только в части случа­ев, его широкому применению должно предшест­вовать решение ряда экспериментальных про­блем, которые будут рассмотрены далее.

^ ГЕЛЕВЫЕ БИОЧИПЫ, ИХ СВОЙСТВА, ПРОИЗВОДСТВО И АНАЛИЗ

Своеобразием и отличием развиваемых нами биочипов является то, что они представляют со­бой полусферические капли гидрогеля, фиксиро­ванные химической связью на поверхности стекла, пластика или силикона (рис. 3). Различные биомо­лекулы равномерно распределяются и иммобили­зуются химическими связями в объеме геля. Им­мобилизация не на двумерной поверхности, а в треххмерном объеме геля дает ряд существенных преимуществ. В десятки и сотни раз увеличивает­ся емкость биочипа на единицу поверхности и со­ответственно увеличивается чуствительность из­мерений. Иммобилизованные макромолекулы как бы фиксированы в гомогенной водной среде, составляющей около 95% объема геля. Это ис­ключает их взаимодействие как друг с другом, так и с твердой поверхностью, где гетерофазные про­цессы с участием фиксированных на ней биомо­лекул протекают более сложным образом. Это особенно существенно для белковых чипов, по­скольку молекулы белков имеют тенденцию де­натурации в интерфазе, образованной между твердой поверхностью и водной средой. Наконец, гелевые элементы на воздухе или под маслом превращаются как бы в изолированные микро- и нанолитровые пробирки, в каждой из которых можно проводить индивидуально различные спе­цифические взаимодействия, химические и фер­ментативные реакции. Благодаря этому гелевые биочипы объединяют в себе свойства и микрома­триц и микролабораторий.

Следует отметить, что решение развивать ге­левые биочипы было подготовлено нашей совме-



стной работой 35-летней давности с Л.С. Сандах-чиевым, ныне академиком РАН, предложившим фиксировать нуклеиновые кислоты в гидрогелях и проводить в них химические реакции для полу­чения высокоочищенной индивидуальной низко­молекулярной тРНК. Наша технология производ­ства гелевых биочипов прошла три этапа разви­тия. Громоздкая и малоэффективная технология первого поколения состояла из пяти стадий и бы­ла разработана и запатентована в ИМБ в 1989— 1993 гг. Она была перенесена в совместную био-чипную лабораторию, организованную ИМБ и Аргонской национальной лабораторией (АНЛ, США) в 1994-2000 гг. и стала технологией перво­го поколения, была лицензирована американски­ми фирмами "Мотороллой" и "Пакардом". Одна­ко из-за ее несовершенства фирмы стали произ­водить биочипы не как микроматрицы гелевых элементов, а как сплошную поверхность поли-акриламидного геля. В ИМБ за последние три го-

ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК том 73 № 5 2003

416

^ НАУЧНАЯ СЕССИЯ ОБЩЕГО СОБРАНИЯ РАН




Рис. 4. Флуоресцентные анализаторы микрочипов для исследований (а) и для клиник (б)

да разработаны технологии производства биочи­пов второго и третьего поколения. Технология второго поколения состоит из трех этапов: моди­фикация иммобилизуемых биополимеров моно­мерными группами геля, нанесение раствора этих веществ в смеси с мономерными звеньями геля с помощью игольчатого или пьезоэлектрического робота и, наконец, фотоиндуцированная сополи-меризация свободных и связанных с биополиме­рами молекул мономера [8]. Это приводит к рав­номерной иммобилизации веществ во всем объе­ме геля. В еще более простой двухэтапной технологии третьего поколения первая и третья стадии получения биочипов объединены с помо­щью своеобразной химической реакции.

Достаточно простая, универсальная и дешевая технология третьего поколения позволяет произ­водить даже в лабораторных условиях сотни и в скором будущем тысячи олигонуклеотидных, ДНКовых или белковых микрочипов в день. Раз­работан также метод получения сополимеризаци-ей микрочипов с размерами гелевых микроячеек до 5 х 5 х 5 мкм. Биочипы (рис. 3) содержат от де-

сятков до нескольких тысяч гелевых элементов с иммобилизованными в них соединениями. Эле­менты микрочипа представляют собой гидроге-левые полусферы (диаметром около 100 мкм), находящиеся на расстоянии 250 мкм друг от друга на гидрофобизованной поверхности стекла. Од-ноцепочечные ДНК длиной до 200-300 нуклеоти-дов и белки с массой до 150 кД легко и достаточно быстро диффундируют в гидрогелевые элементы микрочипов специально разработанного состава. Сам биочип помещен в'реакционную камеру с ка­пиллярным входом и выходом, в которой можно проводить различные процессы в строго контро­лируемых условиях.

^ АНАЛИЗ БИОЧИПОВ

Регистрация происходящих на биочипах про­цессов осуществляется с помощью флюоресцент­ных, а также в некоторых случаях хемилюминис-центных и масс-спектрометрических методов. Для количественного флюоресцентного анализа нами были разработаны совместно с РНЦ "Госу­дарственный оптический институт им. СИ. Вави­лова" флюоресцентные широкопольные высоко-апертурные микроскопы, снабженные ПЗС-каме-рой и компьютером [9]. Прибор (рис. 4) позволяет проводить в реакционной камере количествен­ный анализ в реальном времени сразу всех эле­ментов биочипа в автоматическом режиме, одно­временно при четырех длинах волн, при заданной или меняющейся температуре. Более 20 таких до­статочно дорогих исследовательских анализато­ров биочипов поставлены в лаборатории России и США. Для клиник нами разработан более про­стой и дешевый лазерный анализатор (рис. 4). Он позволяет проводить количественную регистра­цию флюоресценции одновременно со всего био­чипа с помощью более простой ПЗС-камеры и обрабатывать результаты на прилагаемом порта­тивном компьютере с помощью специально со­зданных программ.

Хемилюминисцентные методы, хотя и уступа­ют по чувствительности люминесцентным, поз­воляют значительно упростить и удешевить реги­стрирующую аппаратуру. Кроме того, разрабо­тан специальный метод прямого анализа соединений непосредственно в гелевых элемен­тах с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии. Этот важный в протеомике метод позволяет про­водить дополнительную идентификацию взаимо­действующих с биочипами соединений по их массе.

ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ И ДНКовые МИКРОЧИПЫ

Процесс комплементарных взаимодействий двух нитей ДНК (гибридизация) осложняется су­щественно меньшей стабильностью совершенно-

^ ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК том 73 № 5 2003

БИОЧИПЫ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ XXI ВЕКА

417


го дуплекса А-Т по сравнению с G-C дуплексом и неодинаковым дестабилизирующим эффектом различных неправильных пар оснований. Поэто­му в некоторых типах экспериментов была введе­но измерение кривых плавления, то есть количе­ственной регистрации флюоресценции парал­лельно во всех ячейках микрочипа в градиенте повышающейся температуры. Это позволяет вы­числить термодинамические параметры образо­вания дуплексов: свободную энергию, энтропию и энтальпию. Проведение таких исследований на производимых нами микрочипах, содержащих всевозможные 6-мерные нуклеотиды (всего их 4096), открывает уникальные возможности. Сей­час измеряются термодинамические параметры для 4096 совершенных гексамерных дуплексов и 73728 дуплексов, содержащих всевозможные не­правильные пары оснований во всех положениях гексануклеотидов. Составление полного катало­га термодинамических параметров гексамерных дуплексов позволит создать более точную тео­рию гибридизации и оценить влияние на гибриди­зацию первичной и вторичной структур в ДНК. Эта теория необходима для практических работ с ДНК и, в свою очередь, будет способствовать за­вершению развития метода секвенирования ДНК гибридизацией.

Для широкого применения секвенирования ДНК гибридизацией с полными, например 6-мер­ными или более сложными, микрочипами требу­ется решение ряда проблем. Важной задачей яв­ляется надежная дискриминация совершенных и неправильных дуплексов, образующихся на био­чипе, что затруднено различиями в стабильности А-Т и G-C пар оснований. Измерение кривых плавлений дуплексов и применение алгоритмов, вычисляющих поверхность под кривой плавления для каждого дуплекса, увеличивают надежность анализа. Другим серьезным препятствием являет­ся частое присутствие в ДНК повторяющихся гексануклеотидных и более длинных последова­тельностей. Эту частоту можно оценить количе­ственно, измеряя и сравнивания интенсивности флуоресценции различных элементов биочипа.

Гибридизация с полным 6-мерным биочипом становится привлекательным методом для выяв­ления известных и открытия новых мутаций и нуклеотидного полиморфизма в участках ДНК с известной структурой. Последовательная гибри­дизация с одним и тем же полным биочипом двух фрагментов одного и того же участка генома с из­вестной и анализируемой структурой позволяет выявить различия во флюоресцентной картине и установить структуру и положение измененного основания в ДНК. Таким методом можно выяв­лять присутствие патогенных мутантов в стан-



Рис. 5. Идентификация узнавания белком Р50 специ­фичных участков в ДНК

Флуоресцентно окрашенный белок Р50 связывается с пол­ным 6-мерным олигонуклеотидным микрочипом. Прово­диться измерение флуоресценции белка на каждом элемен­те биочипа в градиенте повышающейся температуры и 7д -температур плавления комплексов белка с олигонуклеоти-дами. Олигонуклеотиды микрочипа, проявляющие наиболь­шую температурную стабильность в комплексе с ДНК, ло­кализованные в светлом кресте и содержащие тетрануклео-тидные последовательности TGGT и GGTC, демонстрируют также и наибольшую специфичность связывания

дартном штамме полиовируса, используемого как полиомиелитная вакцина [10].

Полные 6-мерные биочипы были также ис­пользованы для выявления специфичности ДНК-связывающихся соединений к определенным нук-леотидным последовательностям. Таким спосо­бом была изучена специфичность гистоноподоб-ного бактериального белка HU, низкомолекуляр­ного красителя Хекст 33258, а также белка р50 [11], являющегося регулятором транскрипции и трансляции и открытого группой академика Л.П. Овчинникова (рис. 5).

^ 3 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК том 73 № 5 2003

418

НАУЧНАЯ СЕССИЯ ОБЩЕГО СОБРАНИЯ РАН


Гибридизация с олигонуклеотидными микро­чипами служит для качественной и количествен­ной идентификации нуклеиновых кислот и для анализа структурных вариаций в них. Рибосомы присутствуют во всех живых клетках, а рибосо-мальные РНК являются одними из наиболее эво-люционно консервативных макромолекул. Вмес­те с тем в рибосомальных РНК существуют не­сколько вариабельных участков. Различия в нуклеотидной последовательности этих участков применяются для идентификации микроорганиз­мов и для прослеживания их эволюции. Нами раз­работан ряд микрочипов для экспрессного метода идентификации нитрифицирующих бактерий [12], бактерий групп Bacillus [13] и архебактерий. При­сутствие рибосомальных РНК в клетке в количе­стве тысяч копий позволяет проводить анализ в ряде случаев без их амплификации. Разработана также простая система выделения рибосомаль­ных РНК и их флюоресцентного мечения на од­ной и той же колонке, что позволило создать би-очипный экспресс-метод анализа таких типов би­ологического оружия, как сибирская язва [13]. Мы изучаем также возможность создания биоге­нов для идентификации всех или большей части известных микроорганизмов.

Для качественного и количественного анализа экспрессии генов и содержания различных ин­формационных РНК существует несколько зару­бежных коммерческих биочипных систем. Геле-вые микрочипы были использованы нами также для анализа мРНК, например, для идентификации хромосомных перестроек, вызывающих восемь различных типов лейкемий [14]. Соответствую­щая микрочипная диагностика лейкемий внедре­на в Детском республиканском гематологичес­ком центре.

Олигонуклеотидные микрочипы являются эф­фективным подходом для одновременной иденти­фикации от десятков до тысяч генов и их струк­турного анализа, для выявления специфичных нуклеотидных последовательностей и нуклеотид-ных вариаций в их структуре. Однако когда гены присутствуют в геноме в количестве одной или нескольких копий, требуется их предварительная амплификация. Наиболее эффективным мето­дом амплификации ДНК является полимеразная цепная реакция, в процессе которой происходит экспоненциальное увеличение количества моле­кул ДНК от нескольких до миллионов и более ко­пий, достаточных для проведения их гибридиза-ционного анализа.

В более традиционном и простом подходе амп­лификация ДНК и гибридизация амплифициро-ванной ДНК с биочипом проводятся в две отдель­ные стадии. Такие двухстадийные методы были разработаны нами в совместных исследованиях с

рядом российских и зарубежных лабораторий для идентификации мутаций в (3-глобиновом гене, вызывающем наследственное заболевание р-та-лассемию, определения аллелей в гене гистосов-местимости HLA DQA1, нуклеотидного полимор­физма в гене (х-опиоидного рецептора [15], обуслав­ливающего, вероятно, склонность к наркомании, определения ряда бактериальных генов, ответст­венных за резистентность к антибиотикам и син­тез некоторых токсинов [16].

Гибридизация амплифицированной ДНК с ге-левыми биочипами нашла применение в практи­ке для идентификации мутаций, ответственных за резистентность туберкулезных бацилл к одному из основных противотуберкулезных препаратов -рифампицину [17, 18]. Этот метод прост, недорог и ускоряет анализ от нескольких недель до 1 дня. Метод был разработан совместно с Московским научно-практическим центром борьбы с туберку­лезом и ГНЦ вирусологии и биотехнологии "Век­тор" и опробован более чем на 150 больных в ря­де клиник. Налажен коммерческий выпуск таких наборов для анализа, содержащих олигонуклео­тидные микрочипы, компоненты для амплифика­ции ДНК, включая синтетические флюоресцент­но меченные олигонуклеотиды, клинический анализатор биочипов с портативным компьюте­ром и программой для автоматического анализа биочипов. Этот метод нетрудно адаптировать для обнаружения многих других микроорганизмов, генов лекарственной резистентности и синтеза токсинов, а также для идентификации различных мутаций в вирусах, микроорганизмах, животных (включая человека) и растениях. Введение соот­ветствующих изменений, необходимых для вы­полнения этих задач, можно провести за корот­кое время - от нескольких недель до нескольких месяцев.

В двух других разработанных методах гибри­дизацию на микрочипе объединяют с амплифика­цией на микрочипе в одну стадию, что ускоряет и упрощает анализ. Во втором методе [18] ампли­фикация происходит параллельно в растворе в ре­акционной камере и в гелевых элементах микрочи­па, содержащих иммобилизованные и участвующие в амплификации олигонуклеотиды (праймеры). Та­кой подход был был использован для сокращения идентификации туберкулезной бациллы до 2 ча­сов и определения ее резистентности сразу к двум лекарственным препаратам - рифампицину и изониазиду. В методе используется также аллель-специфичная амплификация, протекающая на иммобилизованных в геле олигонуклеотидах. По­мимо этого, мутации и полиморфные нуклеотиды могут выявляться с помощью ферментативных ре­акций удлинения иммобилизованных на чипе оли-гонуклеотидов на один нуклеотид и их соединения с другими олигонуклеотидами - легирования [18].


ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК том 73

№ 5 2003

^ БИОЧИПЫ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ XXI ВЕКА

419









В третьем методе амплификация происходит исключительно в гелевых элементах микрочипа [19], используемых в этом случае как пробирки объемом от нескольких нанолитров до долей ми­кролитра. Каждая из этих гелевых нанопробирок содержит необходимые для амплификации два и более специфических олигонуклеотида. Метод пока достаточно сложен в исполнении и требует дальнейшей доработки. Однако его реализация позволит анализировать на одном биочипе и в од­ном эксперименте тысячи полиморфных нуклео-тидов в геноме, что позволит использовать его для массового скрининга популяций. Известно, что полиморфизм примерно 3 млн. нуклеотидов из 3 млрд., составляющих человеческий геном, отличает одного человека от другого. Полимор­физм отвечает за наследственные дефекты и па­тологии, предрасположенность ко многим забо­леваниям, в том числе злокачественным, и опреде­ляет многие другие генетически заданные особенности человека. Поэтому создание простого и эффективного микрочипного анализа полимор­физма сразу по многим участкам для каждого инди-видума приблизит человека к цели "Познай самого себя", начертанной приблизительно 2500 лет назад на стене Дельфийского храма в Греции.

На рис. 6 показаны другие биочипы, разрабо­танные для идентификации ряда патогенных ми­кроорганизмов и вирусов, а также для выявления ряда вызывающих рак мутаций. Некоторые из этих биочипов могут быть использованы для бы-

строго и чувствительного выявления биологичес­кого оружия, оспы, сибирской язвы и других по­добного рода болезней.

Технология производства микрочипов позво­ляет с небольшими изменениями получать как олигонуклеотидные и ДНКовые, так и белковые микрочипы, содержащие ферменты, антитела, антигены и т.д. [3,20]. Стабилизирующий эффект иммобилизации в геле позволяет хранить боль­шинство белковых микрочипов в течение меся­цев без потери функциональной активности.

В сотрудничестве с лабораториями членов-корреспондентов РАН Е.В. Гришина и В.А. Не­смеянова (ИБХ, РАН), а также А.Ю. Барышни­кова (Онкоцентр РАМН) нами было продемонст­рировано эффективное применение белковых ге­левых чипов для количественной диагностики ряда токсинов, а также раковых антигенов и ан­тител в крови пациентов. Эти начальные экспе­рименты свидетельствуют, что биочипы конку­рентоспособны в клинической иммунодиагности­ке со стандартными методами.

Перспективно использование белковых чипов в бурно развивающейся протеомике. В этой связи особый интерес представляют следующие две за­дачи:

• качественное и количественное определение параллельно большого количества белков в клетках различных тканей или в различных функциональных состояниях, для чего можно ис-


ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК том 73 № 5 2003

3*

420

^ НАУЧНАЯ СЕССИЯ ОБЩЕГО СОБРАНИЯ РАН





пользовать специфические антитела, как проде­монстрировано на рис. 7, для количественной идентификации антигена рака простаты; в ряде стран уже развернуты программы получения большинства белков человеческих и бактериаль­ных клеток и производства специфических анти­тел к ним; мы надеемся использовать отечествен­ную биочипную технологию для сотрудничества с этими программами с целью создания системы ко­личественного определения клеточных белков;

• изучение взаимодействий клеточных белков друг с другом и другими клеточными лигандами, такими как ДНК и низкомолекулярные соедине­ния; определение специфичности ДНК связываю­щихся белков с помощью полных олигонуклео-тидных микрочипов описано ранее; значительно более сложной задачей является идентификация белков, специфически взаимодействующих друг с другом и лигандами, если хотя бы один компо­нент неизвестен; для этих случаев разработан ме­тод идентификации связывающихся с микрочи­пом молекул с помощью масс-спектрометрии; на белковых микрочипах, содержащих иммобилизо­ванные ферменты, можно проводить также кине­тический анализ их субстратов и ингибиторов [3].

^ КЛЕТОЧНЫЕ МИКРОЧИПЫ

Многие прокариотические и эукариотические клетки, как известно, сохраняют свою жизнедея­тельность и даже могут делиться, будучи фикси­рованы в гидрогеле. Это открывает ряд интерес­ных возможностей, в том числе для создания кле­точных биочипов как матричных биосенсоров



Рис. 8. Клеточный биочип, содержащий различные штаммы бактерий, и его использование для качест­венного и количественного анализа антибиотиков

для параллельного определения, например, ряда антибиотиков и ксенобиотиков. На рис. 8 показан такой бактериальный микрочип [21], содержа­щий иммобилизованные и резистентные к раз­личным антибиотикам штаммы Е. Coli. Фотогра­фия прокрашенного гелевого элемента на рис. 8 свидетельствует о распределении растущих кле­ток по всему объему геля. Кинетика деления и роста бактерий в геле микрочипа регистрируется окрашиванием клеток флюоресцентной краской. Рост бактерий зависит от резистентности клеток к антибиотику и его присутствия в среде. Рисунок показывает бактериальный микрочип, содержа­щий иммобилизованные в геле 4 штамма Е. coli, чувствительные и резистентные к антибиотикам


ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК том 73

№ 5 2003

^ БИОЧИПЫ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ XXI ВЕКА

421



  1. Arenkov P., Kukhtin A., GemmellA. et al. Protein micro­chips: Use for immunoassay and enzymatic reactions // Anal. Biochem. 2000. V. 278. P. 123-131.

  2. Gilbert W. DNA sequencing and gene structure // Sci­ence. 1981. V. 214. P. 1305-1312.

  3. Лысое Ю., Флорентъев В., ХорлинА. и др. Опреде­ление нуклеотидной последовательности ДНК ги­бридизацией с олигонуклеотидами. Новый метод // Докл. Акад. наук СССР. 1988. Т. 303. С. 1508-1511.

  4. Барский В., Колчинский А., Лысое Ю., Мирзабе-ков А. Биологические микрочипы, содержащие иммобилизованные в гидрогеле нуклеиновые кис­лоты, белки и другие соединения: свойства и при­ложения в геномике // Мол. биол., 2002. Т. 36. С. 563-584.

  5. Chechetkin V.R., Turygin A.Y., Proudnikov D.Y., Proko-penko D.V., Kirillov Eu.V. & Mirzabekov A.D. Sequen­cing by hybridization with the generic 6-mer oligonucle­otide microarray: an advanced scheme for data process­ing // J. Biomol. Structure & Dynamics, 2000. V. 18. P. 83-101.

  6. Vasiliskov V., Timofeev E., Surzhikov S., Drobyshev A., Shick V., Mirzabekov A. Fabrication of microarray of gel-immobilized compounds on a chip by copolymeriza-tion//BioTechnique. 1999. V. 27. P. 592-606.

  7. Barsky V., Perov A., Tokalov S. et al. Fluorescence data analysis on gel-based biochips // J. Biomol. Screening. 2002. V. 7. P. 247-257.




  1. Proudnikov D., Kirillov Eu., Chumakov K. et al. Analy­sis of mutations in oral poliovirus vaccine by hybridiza­tion with generic oligonucleotide microchips // Biologi-cals. 2000. V. 28. P. 57-66.

  2. Zasedateleva O., Krylov A., Prokopenko D. et al. Speci­ficity of mammalian Y-box binding protein p50 in inter­action with ss and ds DNA analyzed with generic oligo­nucleotide microchip // J. Mol. Biol. 2002. V. 334. P. 73-87.

  3. Guschin D., Mobarry В., Proudnikov D. et al. Oligonu­cleotide microchips as genosensors for determinative and environmental studies in microbiology // Applied and Environmental Microbiology. 1997. V. 63. P. 2397-2402.

  4. Bavykin S.G., Akowski J.P., Zakhariev V.M., Bar-sky V.E., Mirzabekov A.D. Microbial identification: A portable system for sample preparation and oligonucle­otide microarray hybridization // Appl. & Environ. Mi­crobiology. 1997. V. 67. P. 922-928.

  5. Nasedkina Т., Domer P., Zharinov V. et al. Identification of chromosomal translocation in leukemias by hybrid­ization with oligonucleotide microarrays // Haematolog-ica. 2002. V. 87. № 4.

  6. LaForge K.S., Shick V., Spangler R. et al. Detection of single nucleotide polymorphisms of the human mu opi­oid eceptor gene by hybridization or single nucleotide extension//Am. J. Med. Genet., Neuropsyciatric Genet­ics Section, 2000. V. 96. № 5. P. 604-615.

  7. Strizhkov B.N., Drobyshev A.L., Mikhailovich V.M., Mirzabekov A.D. PCR amplification on a microarray of gel-immobilized oligonucleotides: Detection of bacteri­al toxin- and drug-resistant genes and their mutations // BioTechniques. 2000. V. 29. P. 844-857.

73 № 5 2003
тетрациклину, хлорамфениколу и смеси хлорам- 3. феникола и ампициллина. Подавление роста бак­терий в соответствующих элементах биочипа позволяет идентифицировать присутствие этих 4. антибиотиков в среде. После построения калиб­ровочной кривой содержание антибиотиков в 5. среде может быть измерено количественно. Представляет интерес также создание микрочи­пов, содержащих животные и растительные клет­ки для определения широкого диапазона различ- 6. ных веществ в окружающей среде.

* * *

Развитие технологии биочипов в Институте молекулярной биологии РАН стало возможным благодаря тесному сотрудничеству исследователей различных специальностей - биологов, химиков, физиков, инженеров, математиков. Эта многогран­ность была заложена уже при создании института его основателем, академиком В.А. Энгельгардтом. g В развитии биочипов участвует в той или иной степени более 12 групп и лабораторий института. Кроме того, с 1991 г. нами проводились совмест­ные исследования и разработки с более чем 0 40 отечественными и зарубежными исследова­тельскими и производственными лабораториями и фирмами. Благодаря относительной самодоста- jg точности нам удается продолжать успешную ра­боту и в нынешние, весьма нелегкие для россий­ской науки времена.

Развитие отечественной технологии гелевых П. биочипов и ее различных практических приложе­ний, начатое с 1989 г., получило значительную поддержку, в том числе финансовую, как в Рос­сии, так и в США со стороны ряда государствен­ных и частных организаций. Эффективность pea- 12. лизации этих затрат будет определяться широтой и масштабностью использования отечественной технологии в фундаментальных исследованиях и в приложениях в медицине, биотехнологии, сель­ском хозяйстве, для мониторинга окружающей 13. среды и для борьбы с биотерроризмом. С этой це­лью при активной поддержке Президиума РАН создается Центр коллективного пользования тех­нологией биологических микрочипов при Инсти­туте молекулярной биологии им. ВА. Энгель-гардта РАН. Центр будет предоставлять отечест­венную технологию биочипов сотрудникам РАН, а также и другим государственным и частным уч­реждениям.

ЛИТЕРАТУРА

  1. Reviews: The Chipping Forecast // Nature Genetics. ig 1999. V. 21. P. 1-60.

  2. Khrapko K., Lysov Yu., Khorlin A. et al. An oligonucle­otide hybridization approach to DNA sequencing // FEBS Letters. 1989. V. 256. P. 118-122.

ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК том 73

422

^ НАУЧНАЯ СЕССИЯ ОБЩЕГО СОБРАНИЯ РАН


  1. Mikhailovich V., Lapa S., Gryadunov D. et al. Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by hybridization and polymerase chain reaction on a spe­cialized ТВ-microchip // Bull. Experim. Biol. & Medi­cine. 2001. V. 131. P. 94-98.

  2. Mikhailovich V.,Lapa S., GryadunovD. etal. Identifica­tion of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by hybridization, PCR, and ligase detection reac­tion on oligonucleotide microchips // J. Clinical Micro­biology. 2001. V. 39. P. 2531-2540.




  1. Tillib S., StrizhkovB., Mirzabekov A. Integration of mul­tiple PCR amplification and DNA mutation analyses by using oligonucleotide microchip // Analyt. Biochem. 2001. V. 292. P. 155-160.

  2. Рубина А., Паньков С, Иванов С. и др. Белковые ми­крочипы //Докл. Акад. наук. 2001. № 5. С. 419-422.

  3. ФесенкоД., Наседкина Т., Мирзабеков А. Бактери­альный микрочип: принцип работы на примере об­наружения антибиотиков // Докл. Акад. наук, 2001. Т. 381. №6. С. 831-833.





ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК том 73

№ 5 2003

Добавить документ в свой блог или на сайт

Похожие:

412 научная сессия общего собрания ран iconРассказки Дэна
Харизма сентябрь 2006 (сессия), 41. Андрей Рыжков (сессия), октябрь 2006, февраль 2007, 42. Креолис (сессия), ноябрь 2006, 43. Stigmatic...

412 научная сессия общего собрания ран iconБюллетень для голосования на общем собрании собственников помещений...
Лебедева, города Перми, общего собрания членов тсж «Лебедева-34», в заочной форме

412 научная сессия общего собрания ран iconНаименование, назначение и варианты боевого применения тропосферной станции р-412
Тррс р-412 мобильная, малоканальная тропосферная станция сантиметрового диапазона с частотным разделением каналов и частотной модуляцией...

412 научная сессия общего собрания ран iconЦикл занятий: Хирургия повреждений. Стандарт знаний и практических навыков
Определение понятия «рана». Классификацию ран. Характеристику видов ран. Особенности огнестрельных ран

412 научная сессия общего собрания ран iconРешением Общего учредительного собрания членов кпк «Центр вложений...

412 научная сессия общего собрания ран iconРешением общего собрания учредителей
Полное наименование Организации: Межрегиональная общественная организация "право на оружие"

412 научная сессия общего собрания ран iconУтверждено
Решением Общего собрания членов Некоммерческого партнерства «Союз проектировщиков нефтяной отрасли Северо-Запада»

412 научная сессия общего собрания ран iconИнститут мировой экономики и международных отношений ран государственный...
Г. А. Арбатов, член-корреспондент ран в. Г. Барановский, д пол н. А. Д. Богатуров, член-корреспондент ран о. Н. Быков, член-корреспондент...

412 научная сессия общего собрания ран iconПротокол №1 общего собрания организаторов II межрегионального форума аудиовизуальных искусств
Место проведения: Департамент информационной политики и общественных связей мгуп имени Ивана Федорова

412 научная сессия общего собрания ран iconСовет молодых ученых аф бси дво ран Х дальневосточная конференция...
Журавлев Юрий Николаевич, академик ран (Комиссия по заповедному делу, Директор Биолого-почвенного института дво ран)

Вы можете разместить ссылку на наш сайт:
Школьные материалы


При копировании материала укажите ссылку © 2013
контакты
zadocs.ru
Главная страница

Разработка сайта — Веб студия Адаманов