Формировать у студентов представление о предмете и задачах биологической химии, специфике биохимических лабораторий и особенностях работы с биологическим

^ Опыт 1. Обнаружение АТФ в различных тканях. АТФ в виде нерастворимой бариевой соли осаждается из раствора в щелочной среде после добавления уксуснокислого бария. Приборы. 1. Штатив с пробирками. 2. Ступка с пестиком. 3. Центрифуга Реактивы. 1. Ткани животных (сердце, мозг, печень, скететная мышца, почки и т.д.). 2. ТХУ, 25%-ный раствор. 3. Фенолфталеин, 0,01%-ный раствор. 4. Гидроксид натрия, 10%-ный раствор. 5. Бария ацетат, 25%-ный раствор. Приготовьте 10%-ный раствор гомогената тканей сердца, мозга, печени, скелетной мышцы, почек и т.д. Для осаждения белка к 4 мл гомогената добавьте 4 мл 25%-ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), перемешайте. Через 5 минут слейте в центрифужные пробирки и центрифугируйте 10 минут при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость слейте в чистую пробирку. Обнаружение АТФ. К 5 мл безбелкового фильтрата (надосадочная жидкость), добавьте 2 капли фенолфталеина и подщелачьте 10%-ным раствором NаОН до слабо розового окрашивания. При тщательном встряхивании пробирки добавить в нее по каплям 25%-ный раствор уксуснокислого бария до полноты осаждения, следя за тем, чтобы раствор после добавления уксуснокислого бария оставался щелочным (бледно-розовым). Объясните полученные результаты. Опыт 2. Сопоставление окислительно-восстановительных потенциалов рибофлавина. Приборы. 1. Штатив с пробирками. 2. Набор пипеток. Реактивы. 1. Дистиллированная вода. 2. Рибофлавин, 0,025%-ный раствор. 3. Метиленовая синь, 0,01%-ный раствор. 4. Соляная кислота, концентрированная. Для исследования окислительно-восстановительных потен­циалов применяют индикаторы, имеющие свой цвет при оп­ределенном значении этого потенциала. В пробирку с 4-6 каплями воды добавьте 3 капли взвеси рибофлавина (0,025% раствор) и по каплям 0,01% раствор метиленового синего до появления синего или сине-зеле­ного окрашивания. Внесите в пробирку кусочек цинка и 2-3 капли концентрированной НСl. Отметьте постепенное изменение окраски. Бледно-желтую жидкость слейте в широкую пробирку. Оцените цвет жидкости в пробирке через 10-15 минут. Объясните наблюдаемые явления. Сопоставьте окислительно-восстановительный потенциал рибофлавина и метиленовой сини. Опыт 3. Открытие альдегиддегидрогеназы в молоке. Приборы. 1. Штатив с пробирками. 2. Набор пипеток. 3. Водяная баня. 4. Пробки. Реактивы. 1. Молоко, кипяченое и некипяченое. 2. Формалин, 0,4%-ный раствор. 3. Метиленовая синь, 0,01%-ный раствор. Налейте в пробирки по 3 мл молока из пронумерованных колбочек соответственно (в одной из них молоко кипяченое, в другой  нет). В обе про­бирки внесите 6 капель 0,4%-ного раствора формальдегида и несколько капель 0,01%-ного раствора метиленовой сини (до появления голубого окрашивания). Пробирки встряхните и быстро закройте пробками для того, чтобы создать относительно анаэробные условия. Поместите пробирки в водяную баню (37оС) и отметьте постепенное обесцвечивание метиленовой сини через 5-10 минут (в зависимости от активности фермента) в одной из пробирок. После обесцвечивания содержимое пробирки несколько раз встряхните и наблюдайте за изменением цвета. Определите, в какой пробирке содержалось некипяченое молоко? Объясните, почему Вы сделали такой вывод? Почему после встряхивания обесцвеченной пробирки произошло изменение цвета? Опыт 4. Качественное определение креатинина. Приборы. 1. Штатив с пробирками. 2. Набор пипеток. 3. Газовая горелка. 4. Держатели для пробирок. Реактивы. 1. Мышечная ткань. 2. Пикриновая кислота, насыщенный раствор. 3. Гидроксид натрия, 10%-ный раствор. К 1-2 мл фильтрата мышечной ткани, свободного от белков1, добавьте 3 капли насыщенного раствора пикриновой кислоты (ядовита!). Проведите подщелачивание раствора добавлением нескольких капель 10%-ного гидроксида натрия. Через несколько минут появляется оранжево-красная окраска. Температура ускоряет реакцию. Проделайте опыт с фильтратами красных и белых мышечных волокон. Сделайте вывод о содержании креатинина в разных мышцах и причинах, обуславливающих это различие. Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________ ^ Занятие № 11. «Цикл трикарбоновых кислот» Цель занятия: изучить механизм некоторых реакций цикла Кребса. Освоить метод количественного определения пировиноградной кислоты в моче. ^ ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ: Окислительное декарбоксилирование пирувата как предварительный этап цикла лимонной кислоты. Перечислите витамины и коферменты, задействованные в этом процессе. Реакции цикла лимонной кислоты. Что определяет общее направление реакций в цикле? В какой части клетки протекает этот процесс? Почему? Какие коферменты и витамины участвуют в цикле Кребса? Объясните, как они работают, с указанием конкретных реакций. Расскажите о реакциях цикла Кребса, в результате которых образуются НAДH2 и ФAДН2. Какова дальнейшая судьба этих соединений? Функции цикла трикарбоновых кислот. Объясните, какое значение для цикла лимонной кислоты имеет анаплеротическая реакция? Энергетический выход цикла трикарбоновых кислот. Сколько молекул ATФ образуется в ходе оборота через цикл одной молекулы лимонной кислоты? Все ли молекулы ATФ, образующиеся при полном окислении активного ацетила, синтезируются путем окислительного фосфорилирования. Как регулируется скорость цикла? Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________ Экспериментальная работа. Одним из методов количественного анализа в биохимии является фотокалориметрия. Метод основан на измерении оптической плотности окрашенных растворов, которые получают при взаимодействии субстрата с различными химическими агентами. Концентрация субстрата пропорциональна степени окрашивания раствора. Перед началом лабораторных опытов ознакомьтесь с устройством КФК и правилами работы на нем. Опыт 1. Определение концентрации пировиноградной кислоты (ПВК) в моче. Приборы. 1. Штатив с пробирками. 2. Набор пипеток. 3. Фотоколориметр. 4. Кюветы, 0,5 см. Реактивы. 1. Дистиллированная вода. 2. Моча. 3. Гидроксид натрия, 10%-ный раствор. 4. 2,4-динитрофенилгидразин, раствор. ПВК крови конденсируется с 2,4-динитрофинилгидразином с образованием гидразона, который в щелочной среде дает коричнево-красный цвет раствора. По интенсивности его окраски судят о содержании ПВК. В три пробирки внесите реактивы согласно следующей таблице: Раствор Опытная проба, мл Калибровочная проба, мл Контрольная проба, мл Исследуемый образец 2 - - Калибр. раствор пирувата* - 2 - Дистиллированная вода - - 2 2,4-динитрофенилгидразин 0,8 0,8 0,8 Содержимое пробирок на 15 мин поместите в темное место при комнатной температуре. В каждую пробирку внесите по 1 мл 10%-го раствора NаOH и через пять минут измерьте оптическую плотность при длине волны 620 нм опытной пробы против контрольной (О) и калибровочной пробы против контрольной (К). Расчет проведите по следующей формуле: Концентрация ПВК = Расчет проведите и по готовому калибровочному графику. Калибровочный график зависимости величины оптической плотности раствора (D) от концентрации ПВК в пробе. Сравните полученные значения с нормальными величинами. Каковы причины повышенного содержания пировиноградной кислоты в сыворотке крови и моче? *Стандартный, 1 мг%-ный раствор ПВК готовится из основ­ного раствора путем смешивания 5 мл основного раствора ПВК со 100 мл воды. Основной раствор ПВК готовят разведением 20 мг ПВК или 25 мг пирувата натрия в 100 мл дистиллированной воды. Опыт 2. Определение активности сукцинатдегидрогеназы мышц. Приборы. 1. Штатив с пробирками. 2. Набор пипеток. 3. Ступка с пестиком. 4. Водяная баня. Реактивы. 1. Мышечная ткань. 2. Янтарная кислота, 5%-ный раствор. 3. Метиленовая синь, 0,01%-ный раствор. 4. Растительное масло. 5. Стеклянный песок. Взвесьте 1 г мышечной ткани. Поместите ткань в ступку, тщательно разотрите со стеклянным песком, добавляя 3-4 мл раствора 5%-ной янтарной кислоты. Полученный гомогенат перенесите поровну в 2 пробирки. Содержимое одной пробирки кипятите в водяной бане в течение 3-5 минут. Затем в обе пробирки добавьте по 1 капле раствора метиленовой сини, перемешайте и залейте поверхность жидкости 0,5 мл растительного масла для изоляции от кислорода воздуха. Обе пробирки инкубируйте в водяной бане (40оС) в течение 10 минут. Дайте объяснение наблюдаемым явлениям. Какова функция метиленовой сини в данном эксперименте? На какое соединение эта функция возлагается в живой клетке? Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________ ^ Занятие № 12. «Обмен углеводов (часть 1)» Цель занятия: рассмотреть факторы, влияющие на переваривание углеводов; освоить метод количественного определения глюкозы в крови. ^ ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ: Основные углеводы пищи, их характеристика. Биологическая роль и функции углеводов в организме. Переваривание угле­водов в желудочно-кишечном тракте у моногастричных животных. Ферменты, участвующие в переваривании углеводов. Нарушения переваривания углеводов. Механизмы трансмембранного переноса моносахаридов в клетки. Нарушения всасывания углеводов. Особенности переваривания углеводов у жвачных животных. Пути включения летучих жирных кислот (ЛЖК) в метаболизм. Метаболизм глюкозо-6-фосфата. Регуляция содержания глюкозы в крови. Биологическая значимость данного явления. Синтез гликогена: последовательность стадий и биологическое значение процесса. Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________ Экспериментальная работа. Опыт 1. Воздействие формальдегида на активность амилазы. Приборы. 1. Штатив с пробирками. 2. Набор пипеток. 3. Водяная баня. Реактивы. 1. Крахмал, 1%-ный раствор. 2. Амилаза, раствор. 3. Йод, 1%-ный раствор. 4. Формальдегид, 5%-ный раствор. Возьмите две пробирки. В опытную пробирку налейте по 1 мл растворов крахмала, амилазы и 5%-ного формальдегида. В контрольную пробирку налейте по 1 мл раствора крахмала, амилазы и воды. Поместите пробирки на 20 минут в водяную баню при 30°С. В обе пробирки добавьте по 1 капле 1%-ного раствора йода. Объясните полученные результаты. Где на практике животные могут столкнуться с формальдегидом? Опыт 2. Определение концентрации глюкозы в биологических жидкостях ортотолуидиновым методом. Для определения глюкозы в биологических жидкостях по данному методу в настоящее время различными фирмами выпускаются наборы реактивов. Поэтому суть работы сводится только к правильному использованию набора реактивов согласно инструкции по применению. Глюкоза с ортотолуидином в кислой среде при повышенной температуре образует комплексное соединение сине-зеленого цвета. Интенсивность окраски раствора пропорциональна концентрации глюкозы в исследуемой пробе. ^ Определение без депротеинирования. Без осаждения белков анализируют сыворотку и плазму крови, мочу. Мочу перед анализом разбавляют дистиллированной водой в соотношении от 1:10 до 1:500 и в после­дующем результат умножают на степень разведения. Приготовьте опытную, калибровочную и контрольную пробы по схеме: Объем компонента (мл) опытная проба калибровочная проба контрольная проба Рабочий раствор реактивов (ортотолуидиновый реактив) 2,7 2,7 2,7 Исследуемый образец 0,3   Калибратор (раствор глюкозы с известной концентрацией)  0,3  Дистиллированная вода   0,3 Перемешайте. Закройте пробирки фольгой или крышкой. Поместите пробирки в кипящую водяную баню точно на 8 минут. Охладите пробирку под струей холодной воды. Измерьте оптическую плотность опытной (D1) и калибровочной (D2) проб против холостой пробы при длине волны 620 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 5 мм. Рассчитайте концентрацию глюкозы по формуле: где Х  концентрация глюкозы в калибровочном растворе. Сравните полученные величины с нормальными значениями. Сделайте вывод о состоянии животного. В случае отклонения полученных значений от нормальных величин, предложите возможные причины, объясняющие данный результат. Назовите факторы, вызывающие гипогликемию и гипергликемию в крови животных. Опыт 3. Обнаружение сахара в моче с помощью качественной пробы Троммера. Появление сахара в моче наблюдается при бешенстве, нервной форме чумы собак, нарушениях функции печени, панкреатической железы и др. У лошадей глюкозурия встречается реже, чем у собак. Лактозурия наблюдается при родильном парезе, воспалении вымени, закупорке сосудов, маститах. Приборы. 1. Штатив с пробирками. 2. Набор пипеток. 3. Держатель для пробирок. 4. Газовая горелка. Реактивы. 1. Моча. 2. Гидроксид натрия, 10%-ный раствор. 3. Сульфат меди, 2%-ный раствор. В пробирку налейте 3 мл мочи, 1 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия. Осторожно, по каплям, добавляйте 2%-ный раствор сульфата меди до появления небольшой, неисчезающей при взбалтывании голубой мути гидроксида меди (II). Верхний слой жидкости нагрейте до кипения (не кипятите!). В течение 1 минуты (не дольше!) оцените цвет осадка. Образование желто-красного осадка свидетельствует о наличии сахара в моче. (Изменение цвета без осадка может быть при наличии муцина, мочевой кислоты и др.). Сделайте вывод по результатам эксперимента. Опыт 4. Полуколичественное определение глюкозы в моче. Приборы. 1. Ступка с пестиком. 2. Весы. 3. Предметное стекло. 4. Газовая горелка. 5. Пипетка. Реактивы. 1. Моча. 2. Сульфат меди, кристаллический. 3. Карбонат натрия, кристаллический. В ступке разотрите в тонкий порошок 1 г сульфата меди и 10 г карбоната натрия. На предметное стекло насыпьте немного порошка и нанесите несколько капель мочи. Подогрейте до кипения. Синий цвет означает, что глюкозы нет, желтовато-зеленый означает, что глюкозы не более 0,5 %, зеленый – не более 1%, коричнево-красный – до 2%, интенсивно красный – свыше 2%. Запишите Ваши результаты. Сравните результаты с предыдущим опытом. Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

Похожие:

	Лабораторно – практические занятия по биологической химии Учебное пособие предназначено для студентов педиатрического и стоматологического факультетов медицинских вузов. Материалы пособия...		Экзаменационные вопросы по биохимии для 2 курса лечебного факультета... Предмет и задачи биологической химии. Объекты биохимического исследования. Место биохимии среди других биологических дисциплин. Основные...
	Обратимые электроды и электролиз Стороженко Валентина Николаевна; кандидат химических наук, доцент кафедры органической, биологической и физколлоидной химии Летичевская...		Вопросы к экзамену по химии для студентов фбо (ЗП) ...
	Практикум по биологической химии, изданный в 1986 году, подвергся... Практикум содержит лабораторные работы разной степени сложности, позволяющие студентам приобрести навыки самостоятельного биохимического...		Материалы для подготовки к лабораторной работе №1 «Исследование дисперсии... Цель работы: экспериментальное определение частотной дисперсии электропроводности биологической ткани, определение импеданса биологической...
	Постановление от 19 июня 2012 г. N 602 об аккредитации органов по... По сертификации и испытательных лабораторий (центров),выполняющих работы по подтверждению соответствия,аттестации экспертов по аккредитации,...		Самостоятельная работа студентов по биологической химии Методические... Методические рекомендации предназначены для студентов-медиков и являются руководством в самостоятельной подготовке к семинарам и...
	Методические указания к проведению лабораторных работ по биологической... Методические указания составлены сотрудниками кафедры биохимии и фармакологии медицинского факультета БелГУ: кандидатом биологических...		Вопросы по биохимии Предмет и задачи биологической химии. Место биохимии среди других биологических наук