Скачать 188.13 Kb.
|
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ Российского федерального агентства здравоохранения и социального развития Фармацевтический факультет __________________________ Кафедра фармацевтической химии и фармакогнозииПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ИСПЫТАНИЯ ОБЪЕКТОВ ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА Методические указания к лабораторно-практическому занятию по токсикологической химии для студентов IV курса фармацевтического факультета Нижний Новгород 2013 ^ Цель занятия: Освоение основных методов и подходов, используемых при проведении предварительных испытаний химико-токсикологического анализа. Первичное исследование биоматериала. Составление плана химико-токсикологического анализа по результатам предварительных испытаний. ^ Химико-токсикологический анализ (ХТА) – это совокупность научно обоснованных методов, применяемых на практике для обнаружения и количественного определения ядовитых и сильнодействующих веществ, их метаболитов в биопробах живых лиц, в трупном материале и в вещественных доказательствах отравления. ХТА характеризуется разнообразием объектов исследования, содержащих незначительные количества токсических веществ. Эти вещества являются микрокомпонентами в большом количестве биоматериала. ХТА начинается, как правило, с ознакомления с материалами дела и составления плана исследования. Особенно велико значение заранее продуманного плана исследования при судебно-химических анализах различных вещественных доказательств. План ХТА определяется:
Для составления плана химико–токсикологического анализа большое значение имеют результаты предварительных испытаний. Положительный результат предварительных испытаний указывает на то, что в исследуемом объекте может быть предполагаемое вещество или группа веществ. Но на основании только предварительных проб судебный эксперт не в праве делать заключение о наличие предполагаемого токсического вещества в исследуемом объекте. При положительном результате предварительных испытаний на токсические вещества они включаются в план химико–токсикологического анализа. При отрицательном результате предварительных проб на соответствующие вещества дальнейшее исследование не проводят. Объектами (биопробами) ХТА являются кровь, спинномозговая жидкость, моча, рвотные массы, промывные воды желудка, а также связанные с отравлением вещественные доказательства: лекарственные препараты, растительные объекты, органические растворители, средства бытовой химии, остатки пищи, неизвестные жидкости и др. Проведение предварительных испытаний позволяет более рационально расходовать исследуемый биологический материал или биожидкости, сократить время анализа. На основании результатов предварительных проб судебный химик может исключить ряд веществ из плана химико–токсикологического анализа и предположить, какие вещества могут быть в биологическом материале или биожидкостях. Перед проведением предварительных испытаний ХТА необходимо изолировать исследуемое вещество из биологического материала. Изолирование, независимо от природы яда, производится экстракцией органическими растворителями при различных рН, реэкстракцией, дистилляцией или сорбцией. Вторым этапом после изолирования является качественное определение токсиканта химическими реакциями или физико-химическими методами. При ХТА предварительным испытаниям могут быть подвергнуты жидкости и порошки неизвестного состава, таблетки неизвестных лекарственных средств, объекты растительного происхождения, ткани и жидкости человека. ^ Жидкость, доставленную на исследование, сначала подвергают органо-лептическому анализу. Затем определяют рН, смешиваемость с водой, отмечая полярность и плотность. С водой смешиваются одноатомные низкомолекулярные спирты (метанол, этанол, пропанол), гликоли, эфиры этиленгликоля, ацетон. С водой не смешиваются высшие спирты (С≥4); эфиры алифатических спиртов и ароматические углеводороды (ρ<ρН2О); хлорированные углеводороды (ρ>ρН2О). Показатель преломления жидкости, определяемый рефрактометрически, также является характеристикой, позволяющей определить природу токсиканта. Далее приступают к проведению качественных реакций. В качестве предварительных проб для определения природы яда, чаще всего используют следующие реакции. ^ . Основана на образовании окрашенных в зеленый цвет галогенидов меди (I) при внесении в бесцветное пламя медной проволоки с галогенсодержащими углеводородом. Хлорированные углеводороды окрашивают пламя в зеленый цвет, ароматические углеводороды горят со вспышкой коптящим пламенем. ![]() ^ . В присутствии ароматических углеводородов появляется оранжево-красное окрашивание. ![]() ^ (с сухим реактивом). Применяется в клинической практике для определения ацетона в моче при диабете. Ацетон с натрия нитропруссидом в щелочной среде дает интенсивно-красную окраску. При подкислении уксусной кислотой окраска переходит в красно-фиолетовую. Такую же окраску с нитропруссидом натрия дает метилэтилкетон. Другие окраски с этим реактивом дают ацетофенон, ацетилацетон, ацетоуксусный эфир, диацетил, коричный альдегид и др. С нитропруссидом натрия окрашенные соединения образуют вещества, содержащие енолизируемые СО-группы (—СН2—СО—=S=S—СН=С—ОН). Кетоны, в молекулах которых отсутствуют метильные или метиленовые группы, связанные с СО-группами, не дают этой реакции. Возможный механизм реакции. ![]() ^ При наличии в пробе алифатических спиртов или их эфиров содержимое пробирки приобретает цвет от желто-зеленого до розово-сиреневого. ^ Алифатические углеводороды не растворяют пикриновую кислоту в отличие от ароматических. Проба с 5% раствором меди сульфата. В присутствии гликолей осадок, образующийся при взаимодействии сульфата меди с анализируемой пробой в щелочной среде растворяется, жидкость окрашивается в интенсивно синий цвет (образование комплексного аниона). ![]() Для отличия двухатомных спиртов от трехатомных проводят реакцию с несколькими кристаллами йода. В глицерине йод не растворим, в отличие от двухатомных спиртов. ^ На первом этапе проводят органолептический контроль и физико-химические испытания. Отмечают внешний вид образца, степень его дисперсности, цвет, запах. Проверяют растворимость образца в воде. Хорошо растворимы: соли, углеводы; определяют рН водного раствора порошка. Малорастворимые гидроксиды растворимы в растворах кислот, твердые кислоты – в растворах щелочей. ^ Если до проведения анализа удается по маркировке таблеток установить их класс, то по реакциям на определенные функциональные группы подтверждают природу ксенобиотика и проводят его количественное определение. Если присутствует оболочка, смывают водой. Нерастворимые в спирте наполнители отделяют от раствора, фильтруют. Фильтрат используют для проведения предварительных испытаний. ^ Сначала проводят органолептическое исследование. Далее проводят экстракцию токсичных компонентов смесью этанола и хлороформа (1:2), нагревают, затем фильтруют. Фильтрат используют для проведения анализа. ^ При проведении предварительных испытаний тканей и жидкостей человека прежде всего необходимо визуально установить, какие органы и ткани доставлены на анализ. Их визуальная оценка поможет определить природу токсиканта. ^ исследования, главным образом содержимого желудка, также может свидетельствовать о наличие каких-либо отравляющих веществ (Таблица 1,2). Таблица 1 Окраска содержимого желудка при отравлении различными ядами
Таблица 2 Окраска мочи при отравлении различными ядами
^ исследования может указывать на наличие определенного вещества, вызвавшего отравление. Примерами может служить запах горького миндаля при наличии синильной кислоты, нитробензола или бензойного альдегида; запах этилового спирта, особенно денатурированного (запах пиридиновых оснований); характерный запах сивушных масел, фенола, дихлорэтана и др. Продукты гниения биологического материала, естественно, могут маскировать запах тех или иных веществ. Запах можно определить тогда, когда объекты не подвергались гнилостным изменениям. Поэтому на первом этапе предварительных испытаний следует оценить свежесть биоматериала. Таблица 3 Запах объекта при отравлении различными ядами
^ важна при проведении ХТА, т.к. для токсикантов разной химической природы существует определенный временной интервал между отравлением и отбором пробы, что связано с механизмом поступления, распределения, а также периодом полувыведения токсиканта. При гниении или тлении биоматериала ядовитые вещества, вызывающие отравление, подвергаются различным отравлениям. Характер этих превращений зависит от химической природы ядов, доступа воздуха, влаги, времени гниения или тления и от ряда других факторов. В гниющих биоматериала ядовитые вещества, принадлежащие к различным классам органических соединений, разлагаются быстрее, чем неорганические ядовитые вещества. Из органических ядов наиболее быстро разлагаются сложные эфиры. Большинство органических веществ в биоматериале подвергаются окислению, восстановлению, дезаминированию и др. Превращениям. Более стойкими являются неорганические ядовитые вещества. Большинство этих веществ восстанавливается при гниении биоматериала. Ионы металлов в неорганических ядах, имеющие высшую валентность, восстанавливаются до ионов с низшей валентностью. Поэтому, в первую очередь необходимо определить наличие следов гниения биоматериала. Свидетельством разложения и гниения биоматериала является наличие в нем аммиака и сероводорода: H2S + Pb(CH3COO)2 PbS + 2CH3COOH (черное окрашивание) CuSO4 + NH3 Cu(NH3)22SO4 (синее окрашивание) Консервирование объекта анализа какими либо веществами при отборе проб запрещено. Однако если транспортировка внутренних органов производиться в жаркое время года и может длиться более 5 суток, или в особых случаях (при исследовании биоматериала на наличие сердечных гликозидов), то допускается консервирование чистым этиловым спиртом. Установка факта консервирования при осмотре важна, так как некоторые дальнейшие химические операции, например минерализацию органических веществ концентрированной серной и азотной кислотами, несовместимы с наличием спирта в объекте исследования и необходимо его удаление. В случае консервирования этанолом необходимо указание этого факта в сопроводительных документах и предоставление образца консерванта. Недопустимо консервирование биоматериала в формалине, глицерине, феноле и других растворителях. При ошибочном использовании формальдегида становится невозможным обнаружение метанола, аналитические реакции которого основаны на его окислении до формальдегида. Формальдегид вступает в реакции присоединения с рядом токсичных веществ, например, с аммиаком NH3 и цианидом водорода HCN. Использование формалина в качестве консерванта затрудняет судебно-химическое исследование этих и других токсичных веществ, взаимодействующих с формальдегидом. Если в судебно-химическую лабораторию присланы объекты, консервированные фенолом, формальдегидом или другими веществами, то эксперт-химик должен составить акт о нарушении правил направления объектов на судебно-химический анализ и отправить его лицам, назначившим исследование. По ряду причин консервирование биологического материала этиловым спиртом тоже является нежелательным. Исключением для консервирования служат объекты, подлежащие экспертизе на алкогольное отравление и отравление нитритами. При консервировании биологического материала исключается возможность определения его как вещества, вызвавшего отравление. Кроме этого, наличие в биологическом материале этилового спирта как консерванта мешает разрушению биологического материала при исследовании его на наличие металлических ядов. Поэтому перед разрушением таких объектов необходимо освобождать их от этилового спирта. Качественная реакция на наличие спирта в моче с бихроматом калия проходит с характерным зеленым окрашиванием: 3CH3COOH + 4H2SO4 + K2Cr2O7 → 3HCOH + K2SO4 + Cr2(SO4)3 + 7H2O 3CH3CH2OH + 4H2SO4 + K2Cr2O7 → K2SO4 + Cr2(SO4)3 + 7H2O + 3CH3CHO ![]() Паральдегид (2,4,6 – триметил – 1,3,5 – триоксан) ^ содержимого желудка и мочи имеет большое значение для предварительного решения вопроса о веществах, которые могли вызвать отравление. Реакцию среды определяют обычно не только с помощью лакмуса, но и с использованием других индикаторов: конго, фенолфталеина, универсального индикатора и др. Для определения рН обычно используют водное извлечение из исследуемого биоматериала. Кислая реакция среды может быть обусловлена наличием:
Кислая по лакмусу реакция объекта исключает возможность дальнейшего химико-токсикологического анализа на наличие щелочей. ^ объекта по лакмусу указывает на наличие в нем гидроксильных ионов. В свою очередь наличие данных ионов может быть обусловлено содержанием:
(NH4)2CO3 + HOH → NH4OH + NH4HCO3 Na2SiO3 + HOH → NaOH + NaHSiO3
^ Задание 1. Определение рН среды. Для определения рН среды небольшое количество объекта измельчают, вносят в чашку с дистиллированной с водой, хорошо перемешивают. Затем часть водной вытяжки стеклянной палочкой наносят на универсальную индикаторную бумагу или красную и синюю лакмусовые бумажки. Параллельно ставят контрольный опыт с дистиллированной водой. Покраснение синего лакмуса свидетельствует о кислой реакции среды. При кислой реакции среды необходимо провести исследование с красной бумагой Конго. Посинение красной бумаги Конго свидетельствует о наличии минеральных или органических кислот, введенных извне. Для уточнения характера кислоты водную вытяжку разбавляют в 5-10 раз и вновь исследуют с помощью красной бумаги Конго. При отравлении минеральными кислотами бумага Конго синеет, а в случае органических кислот – не меняет своей окраски. Следует помнить, что слабокислую реакцию среды могут иметь объекты, подвергшиеся кислотному брожению, а также объекты, содержащие малые количества органических кислот. Посинение красного лакмуса свидетельствует о щелочной реакции среды. Для решения вопроса о наличии едкой или карбонатной щелочи в объекте проводят дополнительное исследование: при добавлении к 1 мл водного извлечения капли спиртового раствора фенолфталеина наблюдается розовое или красное окрашивание. К окрашенной жидкости при взбалтывании добавляют 3-5 капель 10% раствора бария хлорида. При наличии в водном извлечении едкой щелочи окраска фенолфталеина не исчезает, в случае наличия карбонатной щелочи – окраска исчезает, появляется белый осадок кальция карбоната. Для определения аммиака часть водной вытяжки после обработки её избытком раствора хлорида бария наносят на красную лакмусовую бумажку. Если посиневшая бумажка через некоторое время (20-30 минут) на воздухе принимает первоначальную окраску (розовеет), делают заключение о наличии аммиака. Испытание на аммиак проводят только при отсутствии едкой или карбонатной щелочи. ^ Часть объекта помещают в коническую колбу на 50 мл, отверстие колбы закрывают пробкой, под которую прикрепляют три бумажки: красную лакмусовую бумажку, смоченную водой; бумажку, смоченную щелочным раствором свинца ацетата; бумажку, смоченную раствором меди сульфата. Колбу оставляют на определенное время (2-3 часа) и по реакции индикаторов судят о наличии аммиака или сероводорода. Если в исследуемом объекте содержится аммиак, то лакмусовая бумажка и бумажка, смоченная меди сульфатом, синеют, последняя – за счет образования меди аммиаката. Если в исследуемом объекте присутствуют сероводород, то бумажка, смоченная щелочным раствором свинца ацетата, чернеет. ^ Задание 3. Предварительные пробы для обнаружения метилового и этилового спиртов в моче.
^ В химико-токсикологическом анализе для обнаружения ацетона применяют реакции с растворами йода, натрия нитропруссида, фурфурола, о-нитробензальдегида и метод микродиффузии.
^
Вопросы для самоподготовки 1. Какое значение имеют предварительные пробы при составлении плана ХТА? 2. Какое заключение делает эксперт-химик, если при исследовании биологического материала реакция среды была кислой? Как определить характер кислоты, введенной извне (минеральная или органическая)? 3. Как определить характер щелочи (едкая или карбонатная) при щелочной реакции среды? 4. Как проводится исследование на наличие аммиака в объекте? 5. Как определить свежесть биоматериала, поступившего на исследование? 6. Можно ли сделать заключение об отравлении аммиаком в случае одновременного обнаружения в биоматериале аммиака и сероводорода? 7. Как проводится предварительное исследование на этиловый и метиловый спирты в моче? Отметить специфичность проб. 8. Как проводится предварительное исследование на галогенопроизводные алифатического ряда? Зачем проводится контрольный опыт при проведении этих реакций? 9. Описать порядок предварительного исследования на наличие ацетона, всегда ли его можно использовать? Список литературы
Приложение ^ Отчет о проделанной работе должен содержать:
АКТ Химико-токсикологического исследования № 1 На основании направления кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Нижегородской медицинской академии от (дата) мною, студентом (номер группы, ФИО) (дата начала исследования) на кафедре фармацевтической химии и фармакогнозии Нижегородской медицинской академии начато судебно-химическое исследование внутренних органов (печень) трупа гражданина Х с целью обнаружения ядовитых и сильнодействующих веществ Обстоятельства дела: неизвестны, письменных сопроводительных документов не поступало. ^ на исследование поступил объект (описание тары, укупорки и надписей). Содержимое склянки представляет собой кусочки печени весом (указать вес), (цвет, запах, наличие инородных включений, рН, консервация). Химическое исследование. Заключение: на основании проведенного судебно-химического исследования внутренних органов (____) трупа гражданина Х, направленных с кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Нижегородской медицинской академии (дата отправления) с целью обнаружения ядовитых и сильнодействующих веществ, найдены (не найдены) (перечисляются все вещества, на которые производилось исследование). Анализ проводил ФИО (подпись) _(дата составления акта)_ |
![]() | Гбоу впо «Пермская государственная медицинская академия им ак. Е. А. Вагнера», Минздравсоцразвития РФ | ![]() | Воронежская государственная медицинская академия имени Н. Н. Бурденко Федерального агентства по здравоохранению и социальному |
![]() | Всем участникам по окончании конференции будут выданы сертификаты участия. Конференция состоится 8 апреля 2014 г. (по адресу: Омская... | ![]() | «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации |
![]() | ... | ![]() | ... |
![]() | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Тюменская государственная медицинская академия | ![]() | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Тюменская государственная медицинская академия |
![]() | Интерпретировать биологические свойства патогенных и непатогенных микроорганизмов, вирусов и закономерности их взаимодействия с макроорганизмом,... | ![]() | Наиболее действенными способами лечения фиброзной формы гипертрофического гингивита являются |