Тема: объекты, принципы и методы диагностической энзимологии




Скачать 262.46 Kb.
НазваниеТема: объекты, принципы и методы диагностической энзимологии
Дата публикации24.07.2013
Размер262.46 Kb.
ТипДокументы
zadocs.ru > Химия > Документы
Занятие 1

Тема: объекты, принципы и методы диагностической энзимологии

Цель занятия: Сформировать у студентов представление об энзимодиагностике, ее преимуществах, возможностях и использовании в современном диагностическом процессе.

Исходный уровень знаний и навыков

Студент должен знать:

  1. Общую организацию структуры клетки. Строение и функции органелл.

  2. Органную локализацию метаболических процессов. Маркерные и органоспецифические ферменты.

  3. Множественные формы ферментов и изоферменты.

  4. Факторы, влияющие на активность ферментов.

  5. Основные методы биохимии, использующиеся в энзимологии.

  6. Систему СИ. Понятие нормы и достоверности полученных данных.

  7. Состав крови и других биологических жидкостей.

  8. Кинетику взаимодействия лигандов с макромолекулами.


Студент должен уметь:

  1. Определять оптическую плотность растворов на абсорбционном фотометре.

  2. Определять содержание вещества в растворе методом титрования.

  3. Интерпретировать полученные данные активности ферментов в биологических жидкостях.

Структура занятия

  1. Теоретическая часть




  1. Энзимодиагностика как направление медицинской энзимологии. Значение для врача.

  2. Объекты энзимодиагностики (плазма крови, моча, лимфа, цереброспинальная, слезная, синовиальная, перитониальная, лаважная бронхоальвеолярная, серозная, амниотическая, семенная жидкости, желчь, пищеварительные соки, отделяемое женских половых органов, пот, кал, мокрота, экссудаты и транссудаты, клетки и биоптаты). Принципы взятия, хранения и доставки биоматериала. Факторы, влияющие на результаты анализа.

  3. Основные ферменты, использующиеся для энзимодиагностики: биохимическая роль, методы определения, клинико-диагностическое значение исследования (ЛДГ, АЛТ, АСТ, фосфатазы, амилаза, транскетолаза, ГДГ, сорбитолДГ, ГГТП, ХЭ, КФК, глицинамидинотрансфераза и др.).

  4. Ферментные тесты при патологических и физиологических состояниях.

4.1 Сердечно-сосудистая система и скелетная мускулатура (острый инфаркт миокарда, стенокардия, миозит, механическое повреждение мышц, миопатии);

4.2 Печень, желчевыводящие пути и пищеварительный тракт (острые и хронические гепатиты, цирроз, холестаз, инфильтративные заболевания, панкреатит, эпидемический паротит, язвенные поражения);

4.3 Костная система;

4.4 Система крови и кроветворения (патологии эритроцитов, анемия, лейкемия);

4.5 Почки и мочевыводящая система (почечная недостаточность, пиелонефрит, гломерулонефрит);

4.6 Опухолевый рост;

4.7 Беременность.

  1. Основные методы, использующиеся при определении активности ферментов.

    1. По типу аналитического сигнала ( а) оптические методы: оптический тест Варбурга, абсорбционная фотометрия, эмиссионный анализ; б) титриметрические методы объемного анализа: кислотно-основное, кондуктометрическое титрование; в) цито– и гистохимия, метод «сухой» химии (тест-полоски);

    2. По методологии анализа (метод конечной точки, кинетический метод – метод непрерывной регистрации).

6. Единицы измерения активности ферментов: катал, МЕ (IU), каталитическая концентрация, удельная активность, молекулярная активность.
II. Практическая часть

1. Инструктаж по технике безопасности (проводится по соответствующим инструкциям ПБ и ТБ).

2. Решение задач.

3. Лабораторные работы.

4. Проведение контроля конечного уровня знаний.
Задачи
1. Для чего используется количественное определение активности ферментов в тканях и биологических жидкостях?

а. Для диагностики заболеваний, связанных с нарушениями функционирования ферментов.

б. При приготовлении ферментных препаратов, используемых в качестве лекарств.

в. Для контроля эффективности лечения ряда заболеваний.

г. Для оценки эффективности лекарственных препаратов, действующих на ферменты-мишени.

2. Какие требования предъявляют к ферментам, которые можно использовать в целях энзимодиагностики?

а. Органоспепифичность ферментов.

б. Выход ферментов в кровь при повреждении органов.

в. Низкая, активность или полное отсутствие ферментов в сыворотке крови в норме.

г. Высокая стабильность ферментов.

3. Объясните биохимический смысл некоторых требований (подчеркнуты), предъявляемых к хранению и использованию ферментных препаратов.

а. Растворение сухого препарата дистиллированной водой комнатной температуры.

б. При растворении препарата перемешивать осторожно, не допуская образования пены.

в. Хранение раствора препарата при низкой температуре.

г. При необходимости длительного хранения высушивание препарата и запаивание в вакуумированные ампулы.

4. Печень крысы гомогенизировали, затем фракционировали на субклеточные фракции путем дифференциального центрифугирования. В каждой фракции определяли активность гистидазы - фермента, катализирующего отщепление аминогруппы от гистидина. Условия для определения активности фермента даны в таблице. Определите локализацию гистидазы.

Условия опыта

Субклеточные фракции

Ядерная

Митохондриальная

Микросомная

Клеточный сок

1. Количество превращенного субстрата (в мкмоль на пробу)

2. Время инкубации фермента с субстратом (в мин)

3. Объем пробы (в мл)

4. Концентрация белка (в мг/мл)

200

5

0,5

2,5

500

15

1,0

3,2

320

10

2,0

0,8

240

8

0,4

0,8

5. Препарат, содержащий 2,0 мг аргиназы, за 10 мин при t = 38°С и рН 9,0 катализировал образование 30 мкмоль мочевины. Рассчитайте удельную активность аргиназы. Объясните, как и почему изменится ( ↓ - уменьшится, ↑ - увеличится) активность фермента, если:

а) инкубационную среду подкислить до рН 5,0;

б) в среду добавить гликоциамин

(NH2-С- NН-СН2-СООН);

││

NH

в) в присутствии гликоциамина увеличить в среде концентрацию аргинина.

6. Холинэстераза при оптимальных условиях (рН 8,4 и t = 37°С) в течение 15 мин катализирует гидролиз ацетилхолина с образованием 100 ммоль холина и уксусной кислоты. Рассчитайте активность фермента. Объясните, как и почему изменится ( ↓ или ↑ ) активность фермента, если:

а) температуру инкубационной среды изменить от 5 до 40°С;

б) в инкубационную среду добавить прозерин;

в) в присутствии прозерина повышать концентрацию ацетилхолина.

7. 0,05 мг трипсина за 15 мин образуют 100 мкмоль тирозина при оптимальных условиях инкубации: рН 8,0 и 37°С. Рассчитайте удельную активность трипсина. Объясните, как и почему изменится активность трипсина, если:

а) рН инкубационной среды снизить до 3,0;

б) температуру инкубационной среды повысить до t = 78°С;

в) в инкубационную среду добавить трасилол (полипептид).

8. 1 мг фермента сукцинатдегидрогеназы за 5 мин катализирует окисление янтарной кислоты с образованием 10 мкмоль фумаровой при 37°С и рН 7,0. Рассчитайте удельную активность фермента в оптимальных условиях. Объясните, как и почему изменится активность фермента, если:

а) рН инкубационной смеси снизить до 4,0;

б) к среде добавить малоновую кислоту;

в) в присутствии малоновой кислоты увеличить концентрацию янтарной кислоты.

9. 5 мг фермента лактатдегидрогеназы за 30 мин катализируют превращение пирувата с образованием 20 мкмоль лактата при 37°С и рН 7,4. Рассчитайте удельную активность фермента в оптимальных условиях. Объясните, как и почему изменится активность фермента, если:

а) рН инкубационной смеси увеличить до 10,0;

б) снизить концентрацию НАД+.

^ 10. В клетках печени человека обнаружена высокая активность аминотрансфераз (аланиновой - АЛТ и аспарагиновой - АСТ).

АЛТ

Ала + -кетоглутарат → Глу + пируват.

АСТ

Асп + α-кетоглутарат → Глу + оксалоацетат.

АЛТ локализована лишь в цитоплазме, АСТ на 1/3 - в митохондриях, на 2/3 - в цитоплазме.

Некротические процессы в тканях (разрушение всех клеточных структур) сопровождаются выходом в кровь всех внутриклеточных ферментов. При воспалительных процессах повышается проницаемость клеточных мембран, и в крови могут обнаруживаться цитоплазматические ферменты.

В таблице приведено распределение активности аминотрансфераз в клетках печени и крови, выраженное в условных единицах.

Органы

ткани

АСТ (условные единицы)

АЛТ (условные единицы)

цитоплазма

митохондрии

цитоплазма

митохондрии

Печень

60

30

80

-

Кровь

-

8

5

-

Определите, каково будет соотношение активности АСТ/АЛТ при остром инфекционном гепатите с некротическими явлениями.

^ 11. Мужчина 52 лет обратился к врачу с жалобами на продолжительные загрудинные боли, удушье. Предварительный диагноз — «инфаркт миокарда». Какие специфические биохимические тесты необходимо провести для подтверждения диагноза?

12. При биохимическом исследовании крови обнаружили резкое повышение активности ЛДГ, АСТ и АЛТ. Коэффициент де Ритиса равен 3,85.

а) Какое заболевание можно предположить у обследуемого?

б) Активность еще какого фермента в сыворотке крови будет повышена?

^ 13. Больной поступил в клинику с диагнозом «острый панкреатит». Активность каких ферментов в сыворотке крови будет повышена по сравнению с нормой:

а) АЛТ;

б) α-Амилазы;

в) ЛДГ;

г) ГДГ;

д) панкреатической липазы.

14. При биохимическом исследовании крови больного получили следующие результаты:

Фермент Активность, Е/л

ЩФ 800

АЛТ 45

АСТ 33

Нарушение функции какого органа можно предположить у обследованного?

15. У больного 62 лет предварительный диагноз «рак предстательной железы». Активность кислой фосфатазы в крови выше нормы.

а) Какой еще биохимический анализ нужно провести для уточнения диагноза?

б) Какие результаты анализа подтвердят диагноз?
^ Лабораторные работы
Лабораторная работа № 1.

Определение активности щелочной и кислой фосфатаз в сыворотке крови по гидролизу бета-глицерофосфата (метод Бодански).

^ Принцип метода. Под действием фермента сыворотки крови бета-глицерофосфат натрия подвергается гидролизу с освобождением неорганического фосфора, по содержанию которого и судят об активности данного энзима.

^ Ход работы. В 4 пробирки (2 опытные — для исследования активности щелочной и кислой фосфатаз и 2 контрольные — для установления содержания в сыворотке неорганического фосфора) приливают по 1 мл соответствующего (щелочного и кислого) раствора бета-глицерофосфата. Первые 2 пробирки на несколько минут помещают в водяную баню или термостат (37°С) с целью прогревания раствора субстрата. Затем осторожно, избегая образования пузырьков воздуха, в пробирки вносят по 0,1 мл свежевзятой сыворотки и полученную фермент-субстратную смесь инкубируют в течение 1 ч при температуре 37°С. Учитывая, что активность кислой фосфатазы в «нормальной» крови обычно весьма незначительна, иногда гидролиз соответствующей пробы проводят три часа; цифру, выражающую результат, делят на 3.

Время термостатирования опытных проб может быть использовано для определения содержания неорганического фосфора в контрольных пробах. Для этого к 1 мл щелочного (или кислого) раствора бета-глицерофосфата приливают 1,1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, после чего добавляют 0,1 мл той же сыворотки; пробы взбалтывают и через несколько минут фильтруют или центрифугируют.

К 1,5 мл отобранного фильтрата (центрифугата) доливают 1 мл молибденового раствора, 1 мл раствора аскорбиновой кислоты, пробы выдерживают в течение 10 мин при комнатной температуре, после чего фотометрируют в красной области спектра, например, на ФЭКе с красным светофильтром в кювете с шириной слоя 5 мм. При учете оптической плотности проб в качестве раствора для сравнения используют дистиллированную воду (вместо нее лучше ставить пробу на реактивы, содержащую бета-глицерофосфат).

Рассчитывают активность щелочной и кислой фосфатаз по калибровочной кривой.

Активность фосфатазы ранее выражали количеством мг неорганического фосфора, образующегося в результате деятельности всей фосфатазы, заключенной в 100 мл сыворотки (единицы Бодански). Для этого по калибровочной кривой находили уровень неорганического фосфора в опытных (Опщ и Опк) и контрольных (Кщ и Кк) пробах. Затем, вычтя из показателей содержания неорганического фосфора в опытных пробах содержание его в контрольных пробах, определяли количество фосфора (мг), которое освободилось при деятельности фосфатазы, заключенной в 0,1 мл сыворотки. Очевидно, что под влиянием ферментативной активности фосфатазы, содержащейся в 100 мл сыворотки, неорганического фосфора выделилось бы в 1000 раз больше.

Отсюда активность щелочной (1) и кислой (2) фосфатаз рассчитывают по следующим формулам:

(Опщ - Кщ) • 1000 = а ед. Бодански (1), (Опк - Кк) • 1000 = а ед. Бодански (2),

где Опщ, Опкщ, Кк) — количество неорганического фосфора, содержащегося в опытных (и контрольных) пробах, 1000 — коэффициент пересчета, а — количество единиц Бодански (ВЕ).

В норме активность щелочной фосфатазы в сыворотке взрослых людей составляет 2—5 ед, у детей — 5—12 ед Бодански. Активность кислой фосфатазы в сыворотке крови взрослых и детей колеблется в пределах от 0,1 до 0,55 ед Бодански.

Приведенный способ выражения активности фосфатаз (в ед Бодански) является устаревшим. В соответствии с требованиями используемой в клинико-лабораторной практике Международной системы единиц активность этих ферментов следует оценивать по количеству выделенного неорганического фосфора (в ммоль) при действии на субстрат 1 л сыворотки за время инкубации 1 ч при +37°С. Пересчет производится по формуле:

а • 474,19.

В норме активность щелочной фосфатазы составляет у взрослых 0,5—1,3 ммоль/(ч*л), кислой фосфатазы — 0,05—0,13 ммоль/(ч*л).

Примечание: не рекомендуется брать кровь для анализа активности кислой фосфатазы в течение 24 ч после массажа простаты или ее инструментального исследования.
Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.
^ Клинико-диагностическое значение определения активности фосфатаз

Повышение активности щелочной фосфатазы в крови происходит главным образом при двух видах патологии: костных заболеваниях, связанных с пролиферацией остеобластов, и болезнях, сопровождающихся явлениями холестаза.

Путем определения активности щелочной фосфатазы удается выявить скрытые формы рахита, а при систематическом обследовании детей — и предрахитические стадии заболевания. Повышение активности фосфатаз в данном случае надо рассматривать как компенсаторный механизм обеспечения потребностей орга­низма в неорганических фосфатах.

У больных с опухолями костей без новообразований костной ткани (остеомы, хондромы, гигантоклеточная опухоль, множественная миелома и др.) активность щелочной фосфатазы не изменяется. Не повышается активность фермента в крови также при деструктивном характере повреждения костей.

Метастазирование опухолей в кости приводит к возрастанию активности щелочной фосфатазы сыворотки крови. Но еще больший подъем активности фермента наблюдается при метастазировании в печень.

Повышение активности ЩФ происходит не только в условиях интенсивного роста костной ткани, но и при ее разрушении: остеопорозе и последующей остеомаляции. Прямое подтверждение этого процесса, к сожалению, возможно только путем биопсии костной ткани. При тяжелом остеопорозе, остеомаляции активность ЩФ в сыворотке крови может быть нормальной или слабоповышенной (в 2—3 раза). Остеомаляция, верифицированная гистологически, может протекать при нормальной активности ЩФ.

Активность ЩФ в сыворотке крови бывает повышена при остеомиодистрофии, развивающейся как осложнение длительного гемодиализа.

У пациентов с болезнью Педжета отмечена достоверная корреляция активности ЩФ и степени поражения скелета. При остеопорозе показана прямая зависимость активности ЩФ крови и экскреции с мочой оксипролина. В этих условиях определение активности ЩФ сыворотки крови можно использовать для оценки эффективности терапии кальцитонином и фосфатами.

При заболеваниях печени, сопровождающихся повреждением паренхимы и острым клеточным некрозом печени (вирусный гепатит, саркоидоз, туберкулез, амилоидоз и лимфогранулематоз, инфекционный мононуклеоз), отмечается умеренное возрастание активности ЩФ. Особенно резкое повышение ее активности встречается при желтой атрофии, абсцессах печени, а также поражениях печени, вызванных некоторыми лекарственными веществами: хлорпромазином, метилтестостероном.

Увеличивается активность щелочной фосфатазы также при обтурационной (механической) желтухе, возникшей вследствие закупорки внутри- и внепеченочных желчных протоков камнем, спайками, опухолью (рак гепатодуоденальной зоны). Кроме освобождения печеночного изофермента ЩФ, холестаз обусловливает также попадание желчного фермента в плазму крови через синусоиды, а также вследствие активации фермента в желчных канальцах. Этим комбинированным эффектом и объясняется высокая чувствительность щелочной фосфатазы к закупорке желчных путей.

Возрастание активности фермента часто наблюдается при холангите и холангиолите, хроническом холецистите.

Исследование активности ЩФ оказывается полезным и в дифференциальной диагностике внутри- и внепеченочного холестаза. В случае экстрагепатобилиарной обструкции при камнях желчного протока и желчного пузыря, а также при новообразованиях в этих органах активность ЩФ повышается в 10 раз и более. Внутрипеченочная обструкция желчных путей при гепатите также сопровождается повышением активности ЩФ, но степень гиперферментемии не превышает 2—3-кратного значения. Острые некротические изменения гепатоцитов могут не сопровождаться повышением активности ЩФ до тех пор, пока в патологический процесс не будут вовлечены желчные канальцы и не будет происходить задержка желчеотделения. В то же время далеко не во всех случаях поражения паренхимы печени имеется четкая корреляционная зависимость между активностью ЩФ сыворотки крови и содержанием в ней билирубина. В начале развития внутрипеченочного стаза повышение активности ЩФ может быть следствием усиления синтеза белка в гепатоцитах; последующее возрастание активности ЩФ в сыворотке крови, особенно в форме макро-ЩФ, связано с нарушением целостности клеток желчных канальцев.

ЩФ высокой молекулярной массы, присутствующая в сыворотке крови больных внутри- и внепеченочным холестазом, представляет собой комплекс фермента с фрагментами плазматической мембраны гепатоцитов, составляющих синусоидальную зону печени. Методом электронной микроскопии установлено, что ЩФ в крови больных, страдающих холестазом, представляет собой везикулы трехслойной структуры. Помимо ЩФ, эти фрагменты плазматической мембраны содержат и другие мембрано-связанные ферменты — гамма-глутамилтранспептидазу, лейцин-аминопептидазу, 5-нуклеотидазу. Специфичный для холестаза липопротеин, названный ЛП-Х, рассматривается как специфичный тест холестаза.

Ассоциация фермента ЩФ с ЛП-Х дала основание назвать такой комплекс холестатическим, хотя более правильно для ЩФ высокой молекулярной массы оставить термин «мембраносвязанный комплекс ЩФ». Он является более чувствительным индикатором ранних сроков холестаза по сравнению с другими тестами.

Повышение активности ЩФ в сыворотке крови отмечено бо­лее чем у 30% больных ревматоидным артритом, однако не найдено корреляции общей активности ЩФ с длительностью заболевания, возрастом, полом и скоростью седиментации эритроцитов. Более высокая по сравнению с нормой активность ЩФ выявлена при ревматоидных васкулитах, гранулематозах и полиартрите, что связывают с вовлечением в процесс гепатобилиарной системы. Тем не менее повышение активности печеночного изофермента ЩФ при ревматизме не связано со степенью тяжести патологического процесса. Следует принять во внимание, что даже терапевтическая доза противовоспалительных препаратов, например салицилатов, приводит к повышению активности аминотрансфераз и ЩФ в сыворотке крови. Изучение спектра изоферментов ЩФ при ревматизме показало, что повышение активности «костного» изофермента в более высокой степени, чем общая активность фермента, коррелирует с клиникой болевого синдрома при анкилозируюшем спондилите.

Активность ЩФ увеличивается при некоторых заболеваниях кишечника: язвенном колите, регионарном илеите, кишечных инфекциях. Повышение ее отмечено и при заболеваниях мышц, карциноме легких, фиброаденоме молочной железы и «почечном рахите».

Лейкемия, в большей степени миелоидная, сопровождается умеренным возрастанием активности щелочной фосфатазы крови. По-видимому, при ней имеет место выход фермента из разрушающихся лейкоцитов в кровь.

Активность ЩФ в сыворотке крови повышается при беременности, достигая максимума к моменту родов; щелочную фосфатазу вырабатывают микроворсинки трофобластической мембраны. Это позволяет расценивать показатель активности ЩФ как тест оценки состояния плаценты при беременности.

^ Снижение активности щелочной фосфатазы в крови возникает при ослаблении остеобластических процессов, например, при замедленном росте у детей.

Активность ЩФ сыворотки крови уменьшается при гипотиреозе, авитаминозе С (цинге), старческом остеопорозе, выраженной анемии, квашиоркоре, ахондроплазии, кретинизме, состояниях, связанных с накоплением радиоактивных веществ в костях

Понижение активности отмечается при хронической миелоидной лейкемии и при некоторых гепатологических заболеваниях.

^ Повышение активности ЩФ в лейкоцитах (сосредоточена в нейтрофилах), выявляемое чаще всего методами цитохимии, отмечается при синдроме Дауна и, по-видимому, связано с нарушениями в 21-й хромосоме.

Содержащийся в плазме крови фермент с молекулярной массой 110 000 Д не фильтруется патологически неизмененными клубочками почек. В связи с этим в норме моча содержит лишь следы активности щелочной фосфатазы.

^ Повышение активности ЩФ в моче отмечается после травматического повреждения почек или их заболевания. Полагают, что это почечный фермент, подвергшийся модификации в моче. Источником высокой фосфатазной активности экскрементов, видимо, является слизистая оболочка кишечника.
^ Повышение активности КФ, в большом количестве содержащейся в предстательной железе, при нормальном уровне ЩФ указывает на новообразования в этой железе.

Возрастание активности КФ наблюдается через 1—2 сут после оперативного вмешательства на предстательной железе (а также при ее биопсии).

Активность КФ значительно увеличивается при повышенном разрушении тромбоцитов, тромбоэмболиях, гемолитических состояниях, поражении костей метастазами опухолей, иногда при миеломной болезни.

Возрастание активности КФ сопровождает болезни почек, поражения гепатобилиарной системы, системы фагоцитирующих мононуклеаров.

Замечено, что активность ревматического процесса коррелирует с возрастанием активности кислой фосфатазы в сыворотке крови. Наиболее высокая активность фермента наблюдается у больных с затяжным и непрерывно рецидивирующим процессами. Этот тест может быть применен для оценки эффективности гормональной терапии и выявления малоактивных форм ревматического процесса с неблагоприятным течением.

Лихорадочное состояние также может, привести к ложному повышению данного показателя.
Лабораторная работа № 2.

^ Колориметрический динитрофенилгидразиновый метод определения активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови (по Севелу и Товареку).
Принцип метода. L-лактат в щелочной среде в присутствии ЛДГ сыворотки и добавленного НАД окисляется в пируват. По степени его образования и судят об активности фермента.

^ Ход работы.

0,1 мл сыворотки, разведенной 1:2, смешивают с 0,3 мл раствора НАД и прогревают 5 мин при 37°С. Затем добавляют 0,8 мл раствора пирофосфорнокислого натрия и 0,2 мл раствора молочнокислого натрия, предварительно прогретых при 37°С. Смесь инкубируют при 37°С в течение 15 мин. Тотчас же после инкубации в пробу доливают 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина и выдерживают ее 20 мин при комнатной температуре. Затем вносят 5 мл раствора едкого натра, содержимое пробирки перемешивают и через 10 мин измеряют абсорбцию в области длин волн 500—560 нм, например на ФЭКе с зеленым светофильтром в кювете с толщиной слоя 10 мм. Регистрируют показатели оптической плотности исследуемой пробы, учитывая абсорбцию контрольной.

Контрольную пробу ставят так же, как опытную, но разведенную 1:2 сыворотку добавляют после инкубации смеси. Рассчитывают активность фермента по калибровочному графику. Активность лактатдегидрогеназы выражают в ммоль пировиноградной кислоты, образовавшейся при инкубации 1 л сыворотки в течение 1 ч при 37°С. Нормальные величины активности общей ЛДГ в сыворотке крови — от 0,8 до 4 ммоль/ч • л.

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.

^ Клинико-диагностическое значение определения общей активности ЛДГ

В связи с тем, что фермент ЛДГ содержится практически во всех тканях, констатация повышения общей активности лактатдегидрогеназы не имеет большого значения для дифференциальной диагностики заболеваний внутренних органов.

^ Повышение активности лактатдегидрогеназы. Активность ЛДГ в сыворотке крови возрастает у больных, страдающих анемией (гемолитической, пернициозной, мегалобластной, серповидно-клеточной), обширным карциноматозом, опухолями, лейкозами, лимфомой, вирусным и невирусным гепатитом, обтурационной желтухой, циррозом печени, различными заболеваниями почек, опорно-двигательного аппарата, инфарктом миокарда и легкого, а также при любом другом повреждении клеток, приводящем к цитолизу и утрате цитоплазмы (этот фермент, широко представленный в тканях организма, легко переходит в плазму крови при некробиотических процессах в клетках).

При остром гепатите активность лактатдегидрогеназы в сыворотке крови увеличена в первые недели желтушного периода. Активность энзима значительно повышается при разнообразных формах хирургической патологии, сопровождающихся шоковым состоянием, выраженной гипоксией, декомпенсацией сердечно-сосудистой деятельности.

У больных инфарктом миокарда активность фермента в сыворотке крови повышалась через 8—10 ч после начала приступа, достигая максимума через 24—28 ч, оставалась увеличенной на протяжении первой недели заболевания, нормализуясь к 8—9-м сут. Характерно, что общая активность сывороточной ЛДГ у больных инфарктом миокарда сохранялась повышенной вдвое дольше, чем активность других ферментов. Ценность данного теста особенно велика в неясных случаях заболевания, при нетипичной клинической и электрокардиографической картине инфаркта миокарда. У больных со стенокардией активность ЛДГ в сыворотке крови не увеличивалась. Общая активность ЛДГ у больных острым крупноочаговым инфарктом ми­окарда значительно повышалась уже в 1-е сут заболевания. Максимальный уровень ЛДГ (превышающий норму в 4—5 раз) наблюдался на 2-е сут, активность фермента оставалась высокой на 3-й, 4-е и 7-е сут, даже на 15-е сут заболевания она была достоверно выше, чем в контрольной группе. Установлена достоверная прямая корреляционная связь между размером очага омертвения в миокарде и общей активностью ЛДГ. Исследование общей активности ЛДГ имеет не только диагностическое, но и прогностическое значение. При мелкоочаговом инфаркте миокарда сдвиг активности ЛДГ умеренный. При высоком уровне ЛДГ следует опасаться неблагоприятного исхода заболевания, так как это обычно свидетельствует о наличии обширного, нередко трансмурального инфаркта миокарда. Следует отметить, что увеличение общей активности ЛДГ наблюдается не только при остром инфаркте миокарда, но также гемолизе любого происхождения (in vivо и in vitrо), анемии (гемолитической, пернициозной, серповидноклеточной, мегалобластной), остром некрозе почек. При желчнокаменной болезни без обтурации желчных ходов повышения активности ЛДГ не отмечено, тогда как у больных обтурационной желтухой на почве новообразования, билиарным циррозом, с опухолями поджелудочной железы она резко увеличена. То же наблюдается при желчном перитоните, когда в патологический процесс вовлекается печень.

К увеличению общей активности ЛДГ приводит прием алкоголя, кофеина, введение анаболических стероидов, тестостерона, обезболивающих препаратов, дикумарина, хинидина, сульфаниламидов, кодеина, клофибрата, мисклерона.

^ Снижение активности лактатдегидроганазы. Существует две группы причин, обусловливающих сниже­ние активности фермента в крови и тканях. Одна из них связана с наличием ингибитора в сыворотке (плазме) крови, вторая — с генетическими нарушениями. Действительно, в сыворотке крови даже практически здоровых взрослых людей существует термозависимый ингибитор, присутствие которого снижает активность ЛДГ. При исследовании 20 000 образцов сыворотки крови выявлено 42 случая низкой активности ЛДГ. В качестве ингибиторов активности фермента крови выступают IgG, IgА, IgM.

Уменьшение активности ЛДГ вызывают оксалаты (используемые в качестве антикоагулянтов) и мочевина.

Лабораторная работа № 3.

^ Определение активности липазы в сыворотке крови по Гольдштейну и Рою.

Принцип метода. Освободившиеся из расщепляемого липазой трибутирина жирные кислоты отгитровывают щелочью. По разнице в объеме раствора щелочи, которая требовалась на титрование опытной и контрольной проб, судят об активности фермента.

^ Ход работы.

В колбочки вместимостью 50 мл вносят по 0,2 мл трибутирина, 2,5 мл дистиллированной воды, содержимое встряхивают до получения однородной эмульсии. Затем добавляют по 5 мл раствора ацетата кальция и 5 мл буферного раствора; в опытную (опытные) колбу вносят 0,5 мл сыворотки (или панкреатического сока в разведении 1:50 либо 1:100), тщательно перемешивают и ставят в термостат для выдерживания при 37°С в течение 1 ч. После этого во все колбы добавляют по 5,0 мл инактивирующей смеси, а в контрольную — дополнительно 0,5 мл сыворотки. После перемешивания к содержимому колб приливают 0,5 мл раствора фенолфталеина и производят титрование 0,1н раствором щелочи (NaOH или КОН) до появления устойчивой ярко-розовой окраски (вначале титруют контрольную пробу, затем опытную — до цвета содержимого колбочки с контрольной пробой).

Активность липазы выражают в пересчете на 100 мл сыворотки (панкреатического сока).

1 ед активности фермента — это мера активности, под действием которой за 1 ч инкубации при 37°С из трибутирина высвобождаются жирные кислоты, содержание которых соответствует таковому в 1 мл 0,1н раствора жирной кислоты.

Р а с ч е т. От количества (мл) раствора щелочи, пошедшей на титрование опытной пробы, отнимают объем раствора щелочи (в мл), затраченной на титрование контрольной, и полученный результат умножают на 200. Ответ выражают в единицах активности панкреатической липазы.

П р и м е р. На титрование контрольной пробы ушло 0,4 мл раствора NаОН, а на титрование опытной — 1,2 мл. Расчет: (1,2 мл - 0,4 мл) • 200 = 160 ед (на 100 мл сыворотки крови).

Норма: 60—160 ед в сыворотке крови, 50—1500 ед — в панкреатическом соке (на 100 мл биологической жидкости).
Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.
^ Клинико-диагностическое значение определения активности панкреатической липазы.

Повышение активности панкреатической липазы в сыворотке крови отмечено при панкреатите любого происхождения, в особенности — остром панкреатите, при котором активность фермента повышается также в асцитической жидкости. У больных панкреатитом целесообразно одновременно исследовать активность липазы в крови и моче, поскольку в последней она оказывается повышенной чаще, чем в крови.

К преимуществам определения активности липазы в крови относится более длительная гиперлипаземия. То же выявляется у больных карциномой поджелудочной железы и перитонитом.

Увеличение активности фермента в плазме (сыворотке) крови происходит при желчной колике, странгуляции или инфаркте кишки, перфорации полого органа, ожирении, подагре, у части больных сахарным диабетом, а также у страдающих уремией, острой недостаточностью почек (вследствие застоя).

^ Низкие показатели активности липазы обнаружены у больных туберкулезом, сифилисом, раком, при различных инфекционных заболеваниях, причем по мере прогрессирования патологического процесса активность фермента все более снижается. Лекарственные препараты, провоцирующие спазм сфинктера Одди (наркотические средства, анальгетики, секретин), гепарин (стимулирующий высвобождение липазы) активируют этот фермент.

Таким образом, активность липазы (панкреатической) значительно увеличивается относительно нормы (показатель ее у практически здоровых взрослых людей менее 190 Е/л) при остром панкреатите, задержке желчи в печени (внутрипеченочном холестазе), хроническом панкреатите (обструктивном), недостаточности деятельности почек (когда уровень креатинина в плазме (сыворотке) крови повышается до 0,264 ммоль/л, или 30 мг/л).
III. Рекомендуемая литература

  1. Биохимические основы патологических процессов: Учеб. пособие/ Под ред. Е.С. Северина. – М.: Медицина, 2000. – 304с.: ил.

  2. Вилкинсон Д. Принципы и методы диагностической энзимологии: Пер. с англ. – М.: Медицина, 1981, 624с., ил.

  3. Врожденные и приобретенные энзимопатии/ ПОД РЕД. Т. Ташева: Пер. с болг. – М.: Медицина, 1980, 368с.

  4. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: В 2т. Т.1. – Мн.: Беларусь, 2000. – 495с.:ил.

  5. Клиническая биохимия/ Под ред. В.А. Ткачука. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2002. – 360с.: - (серия «ХХIвек»).

  6. Комаров Ф.И., Коровкин Б.Ф., Меньшиков В.В. Биохимические исследования в клинике – Элиста: АПП «Джангар», 1999. – 250с.

  7. Маршалл В.Дж. Клиническая биохимия/ Пер. с англ. – М. – СПб.: «Издательство БИНОМ» - «Невский Диалект», 2000. – 368с., ил.

  8. Мосс Д.В., Баттерворт П.Дж. (пер. с англ.). М., «Медицина», 1978, 288с., ил.

  9. Рослый И.М., Абрамов С.В., Акуленко Л.В. Принципы анализа ферментации. Учебное пособие по курсу клинической биохимии для системы послевузовского образования, Москва 2003

  10. Руководство по клинической лабораторной диагностике. Ч.3. Клиническая биохимия: Учеб. пособие/ М.А. Базарнова, З.П. Гетте, Л.И. Кальнова и др.; Под. ред. проф. М.А. Базарновой, проф. В.Т. Морозовой. – 2-е изд., перераб. и доп. – К.: Выща шк., 1990. – 319с.: ил.

  11. Сборник тестов и задач по биохимии. Учебное пособие/ Под ред. И.П. Ашмарина и А.Я. Николаева. М.: Изд-во МГУ, 1996. – 233с.

  12. Чиркин А.А. Клинический анализ лабораторных данных/ Чиркин А.А. – М.: Мед. лит., 2004. – 384с.:ил.

Добавить документ в свой блог или на сайт

Похожие:

Тема: объекты, принципы и методы диагностической энзимологии iconЭкологическая экспертиза. Принципы и методы экологической экспертизы
Экологическая экспертиза. Принципы и методы экологической экспертизы. Экологическая экспертиза природных экосистем, технологических...

Тема: объекты, принципы и методы диагностической энзимологии iconОсновные принципы и методы оценки эффективности
Инвестиции – средства (денежные средства, ценные бумаги, иное имущество, в т ч имущественные права, имеющие денежную оценку), вкладываемые...

Тема: объекты, принципы и методы диагностической энзимологии iconПлан занятия Сущностные характеристики и направления воспитания....
...

Тема: объекты, принципы и методы диагностической энзимологии iconВопросы по экологическому праву 2012 год
Компоненты окружающей среды как объекты природы, объекты (хозяйствования) использования, объекты собственности. Влияние этого триединства...

Тема: объекты, принципы и методы диагностической энзимологии iconВопросы по экологическому праву 2012 год
Компоненты окружающей среды как объекты природы, объекты (хозяйствования) использования, объекты собственности. Влияние этого триединства...

Тема: объекты, принципы и методы диагностической энзимологии iconТема 3 Основные принципы действия регуляторных механизмов клетки
Принципы регулирования физиологических процессов клеткой (межклеточные системы регуляции)

Тема: объекты, принципы и методы диагностической энзимологии iconТема: Предмет и система земельного права
Цель занятия: определить специфические черты земельных отношений как предмета земельного права, методы, систему и принципы земельного...

Тема: объекты, принципы и методы диагностической энзимологии iconО в белова Общая психодиагностика Автор-составитель О. В. Белова...
Тема психологическая диагностика как наука тема классификации психодиагностических методов тема стандартизованные методы психодиагностики...

Тема: объекты, принципы и методы диагностической энзимологии iconУчреждение образования «белорусская государственная сельскохозяйственная...
В. А. Сивцова (тема 5), Л. Н. Ковалева (тема 7), И. Т. Эйсмонт (тема 2), Н. А. Беляцкая (тема 6), М. А. Михайлова (тема 13), равовой...

Тема: объекты, принципы и методы диагностической энзимологии iconПеречень вопросов к зачету по всему курсу
Предмет, объекты и методы товароведения, его связь с естественными, общественными и техническими науками

Вы можете разместить ссылку на наш сайт:
Школьные материалы


При копировании материала укажите ссылку © 2013
контакты
zadocs.ru
Главная страница

Разработка сайта — Веб студия Адаманов