Исследование мочи




НазваниеИсследование мочи
страница8/12
Дата публикации20.12.2013
Размер1.52 Mb.
ТипИсследование
zadocs.ru > Медицина > Исследование
1   ...   4   5   6   7   8   9   10   11   12

^ Определение величины кровопотери

Принцип. Величина кровопотери пропорциональ­на падению относительной плотности крови. Определять относительную плотность можно с помощью серии раст­воров сульфата меди с заранее известной относительной плотностью.

Реактив — основной и рабочие растворы сульфа­та меди готовят так, как указано в методике определе­ния белка по относительной плотности сыворотки крови.

Ход определения. Из пипетки с высоты 1—2 см в отдельные рабочие растворы выпускают по капле кровь и 10 с следят за поведением капли. Относитель­ная плотность раствора, в котором капля в течение 10 с будет находиться во взвешенном состоянии, т. е. не всплывет и не пойдет на дно, будет равна относительной плотности сыворотки.

Содержание гемоглобина, величину кровопотери и показатель геглатокрита определяют по табл. 4.

Таблица 4

Определение содержания гемоглобина, величины кровопотери и показателя гематокрита

Относительная плотность крови

Содержание ге­моглобина, I/Л

Величина крово­потери, мл

Показатель гемдтокрига

1,057—1,054 1,053—1,050 1,049—1,044 1,044 и ниже

108—103 101— 83 88— 63 Ниже 71

До 500 От 500 до 1000 От 1000 до 1500 Более 1500

0.44—0,40 0,38—0,32 0,23—0,20 Ниже 0,20


^ Колориметрический метод определения активности аспартат-аминотрансферазы и аланин-аминотрансферазы

Принцип. Основан на большой разнице поглоще­ния света при определенной длине волны (508 нм) ди-нитрофенилгидразонами о-кетоглутаровой кислоты, ща-

63
велево-уксусной и пировиноградной кислот. В резуль­тате псреаминирования, происходящего под действием аланип-аминотрансферазы (АЛТ), образуется пиро-виноградная кислота, а при действии аспартат-амино-трансферазы (ACT) — щавелево-уксусная кислота (по­следняя относительно легко превращается в пировино-градную кислоту). При добавлении к реакционной смеси раствора 2,4-динитрофенилгидразина фермента­тивный процесс останавливается и образуются гидразо-ны а-кетокислот. По мере увеличения содержания пиро-виноградной кислоты и соответствующего уменьшения содержания а-кетоглутаровой кислоты оптическая плот­ность смеси гидразонов возрастает. Повышение оптиче­ской плотности пропорционально увеличению концент­рации пировиноградной кислоты в пробе, что является функцией активности аминотрансфераз. Реактивы:

1. 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,4.

2. Субстрат для определения активности ACT: берут 6 мг а-кетоглутаровой кислоты и 540 мг L-аспарагино-вой кислоты, добавляют 1 н раствор едкого натра до их полного растворения, затем доводят этой же щелочью до рН 7,4 (по индикаторной бумаге) и доливают бу­ферным раствором до 20 мл. Реактив нестоек, поэтому его готовят в небольшом количестве. Сохраняют в реф­рижераторе. При приготовлении субстратного раствора в большом количестве его необходимо сохранять в хо­лодильнике в замороженном виде. Перед работой замо­роженный субстратный раствор должен полностью от­таять.

3. Субстрат для определения активности АЛТ: по­мещают 6 мг а-кетоглутаровой кислоты и 356 мг L-ала-нина в небольшой химический стакан и добавляют 1 н раствора едкого натра до полного их растворения. За­тем этим же раствором едкого натра рН смеси доводят до 7,4 и доливают до 20 мл фосфатным буфером; рН раствора проверяют с помощью индикаторной бумажки.

4. Раствор 2,4-динитрофенилгидразина: 19,8 мг 2,4-динитрофенилгидразина растворяют в 100 мл 1 н раствора соляной кислоты. Раствор хранят в темной склянке.

5. 0,4 н раствор едкого натра.

Ход определения активности ACT. В пробирку вносят 0,5 мл буферно-субстратной смеси и помещают в водяную баню при температуре 37° С на

64

10 мин, затем добавляют 0,1 мл сыворотки и инкубиру­ют при температуре 37° С в течение 60 мин. Когда вре­мя инкубации опытной пробы подходит к концу, гото­вят контроль: в пробирке смешивают 0,5 мл буферно-субстратной смеси и 0,1 мл сыворотки, после чего про­бы (опытная и контрольная) обрабатывают одновремен­но. В пробирки добавляют 0,5 мл раствора 2,4-динитро-феннлгидразина и оставляют на 20 мин при комнатной температуре. Затем в каждую пробирку приливают по 5 мл 0,4 н раствора едкого натра и перемешивают. Через 10 мин пробы фотометрируют против воды на фотоэлектроколориметре в кювете толщиной 1 см (све­тофильтр № 4 с максимумом пропускания в 508 нм). При работе на фотоэлектроколориметре для повыше­ния чувствительности определения следует на пути пучка света в фотоэлектроколориметре ставить допол­нительную кювету (толщина рабочего слоя 2 см) с на­сыщенным раствором сульфата меди, получая при этом сине-зеленый светофильтр, полоса пропускания которого ближе к 508 нм.

Ход определения а ктивности АЛТ. В проиирку вносят 0,5 мл буферно-субстратного раствора для определения АЛТ и помещают в водяную баню при температуре 37" С на 10 мин. Затем добавляют 0,1 мл сыворотки и инкубируют в течение 30 мин при темпера­туре 37й С. Дальнейший ход анализа осуществляют так же, как и при определении активности ACT.

Расчет. Разность показании фотоэлектроколори-метра между опытной и контрольной пробами указывает на изменение оптической плотности в результате про­шедшей ферментативной реакции. Изменение оптиче­ской плотности, выраженное в единицах экстинкции и умноженное на 100, можно условно принимать за ак­тивность аминотрансфераз. Однако правильнее актив­ность ферментов выражать в микромолях образовав­шейся пировиноградной кислоты на 1000 мл сыворотки за 1 ч или в миллимикромолях на 1 л сыворотки за 1 ч. В этом случае расчет активности аминотрансфераз производят с помощью калибровочного графика зави­симости оптической плотности от содержания пирови­ноградной кислоты. При построении калибровочного графика можно пользоваться схемой, приведенной в табл. 5.

В пробирки наливают ингредиенты, указанные в табл. 7, перемешивают и через 20 мин добавляют по

5 Зак. 956

65

Та блица В

Схема построения стандартного ряда (стандартный раствор пирувата натрия— 11 мг/100 мл)

Номер пробирки

Стандартный раствор пнрувата натрия, мл

Содержание пировиноградной кислоты, мнмоль

Субстрат для ACT или АЛТ •

Раствор 2,4-ди-ннтрофенилгид-Разина, мл

1

0,05

0.05

0,55

0,5

2

0,10

0,10

0,50

0,5

а

0,15

0,15

0,45

0,5

4

0 .20

о.ао

0,40

0,5

5

0.25

0,25

0,35

0,5


* При построении калибровочного графика для расчета активно­сти ACT используется субстрат ACT, а активности АЛТ — субстрат АЛТ.

5 мл 0,4 н раствора едкого натра. Пробы оставляют при комнатной температуре на 10 мин и затем фотомет-рируют на фотоэлектроколориметре против контроля на реактивы. Контроль на реактивы ставят, как и стан­дартные пробы, но вместо раствора пирувата натрия добавляют дистиллированную воду.

Активность ACT в норме составляет 100—450 мкмо-лей пировиноградной кислоты на 1 л сыворотки за 1 ч ' инкубации при температуре 37° С; активность АЛТ 0,1—0,68 ммолей пировиноградной кислоты на 1 л сы­воротки за 1 ч инкубации при температуре 37° С.

Определение активности а-амилазы в сыворотке крови

Принцип. Метод основан на определении количе­ства крахмала, оставшегося нерасщепленным после ферментативной реакции.

Реактивы:

1. 2% раствор .крахмала: 200 мг растворимого крах­мала растирают с несколькими миллилитрами (1—2мл) холодной воды и количественно переносят в кипящую воду. Размешивают и после охлаждения до комнатной температуры доливают до 5 мл водой.

1 Для перевода в международные единицы (микромоль пиро­виноградной кислоты на 1 мл сыворотки за мииуту пра температу­ре 37° С) результат умножают на 16,7,

2. 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,2; 72 мл 0,1 М

раствора NasHPt^ (19,595 г/л) смешивают с 28 мл 0,1 М раствора КНаР04 (14,978 г/л).

3. 3% раствор хлорида натрия.

4. 1 н раствор соляной кислоты.

5. 0,1 н раствор йода: растворяют 30 г йодида калия в 250 мл дистиллированной воды, туда же вносят 12,7 г кристаллического йода и, добавляя дистиллирован­ную воду, доводят объем до 1000 мл. Хранят в темноте.

Ход определения. 0,5 мл крахмального раст­вора смешивают с 0,3 мл фосфатного буфера и 0,1 мл 3% раствора хлорида натрия. Пробирки нагревают в течение 10 мин при температуре 37° С. После этого в опытные пробы добавляют 0,1 мл сыворотки или мочи, а в контроль — 0,1 мл воды. Перемешивают и помеща­ют в термостат на 30 мин при температуре 37° С. Инку­бацию прерывают прибавлением 0,1 мл 1 н раствора со­ляной кислоты. Затем 0,2 мл содержимого пробирки пипеткой переносят в мерную колбу на 50 мл, куда прибавляют 40 мл воды, 0,5 мл 1 н раствора йода и до­полняют объем до метки дистиллированной водой.

Опытную (Еоп) и контрольную (Ек) пробы фотомет-рируют с помощью ФЭК с красным светофильтром (600—620 нм). Кювета толщиной 1 см. Фотометрию

производят против воды: в— оп 10-20=^мг крахмала,

Еа

гидролизованного 1 мл сыворотки или мочи за 1 ч ин­кубации при температуре 37°С, где 10 — количество миллиграммов крахмала, введенного в опытную и конт­рольную пробы; 20 — коэффициент пересчета на 1 мл сыворотки или мочи за 1 ч инкубации.

Нормальные показатели активности фермента для сыворотки крови 16—30 г/ч. л, в моче—до 160 мг крах­мала, гидролизованного 1 мл биологической жидкости за 1 ч инкубации при температуре 37° С.

Экспресс-метод определения активности холинэстеразы с помощью индикаторной бумаги, выпускаемой заводом «Реагент» (г. Рига)

Принцип. Холинэстеразная индикаторная бумага представляет собой полоску хроматографической бу-

маги размером 65Х10 мм с линией перфорации, отде­ляющей конец индикаторной бумаги — 20Х10 мм, про­питанной ацетилхолином и индикатором, меняющим цвет в зависимости от рН среды. После контакта ис­следуемой сыворотки с индикаторной бумагой под вли­янием холинэстеразы наступает гидролиз ацетилхолина и освобождается уксусная кислота, которая влияет па рН и меняет цвет индикатора. Реакция должна продол­жаться до тех пор, пока рН не достигнет определен­ного уровня, а соответствующий этому цвет индикатор­ной бумаги не сравняется с цветом эталона. Мерои ак­тивности холинэстеразы является время (мин), на про­тяжении которого под влиянием исследуемой сыворотки происходит изменение цвета индикатора бумаги вплоть до совпадения с цветом эталона.

Ход определения. Пипеткой наносится 0,05 мл сыворотки крови на поверхность химически чистого предметного стекла. Стекло должно лежать на белой бумаге (белый фон). На каплю сыворотки, находящую­ся на предметном стекле, помещают пропитанный ко­нец индикаторной бумаги до границы с линией перфо­рации. Затем быстро накладывают второе предметное стекло, слегка прижимая его для равномерного распре­деления сыворотки в полоске индикаторной бумаги. Верхнее стекло не следует снимать, чтобы не вьпвать высыхания бумаги. Рядом кладут эталон — полоску бумаги желто-зеленого цвета. Определение должно про­водиться при температуре 18—22° С. Индикаторная бу­мага в сухом виде имеет желтый цвет; после контакта с сывороткой цвет ее становится темно-зеленым или сине-зеленым, а затем меняется в пределах различных оттенков с зеленого цвета и в конце определения срав­нивается с желто-зеленым цветом бумаги эталона.

Отсчет времени ведется с момента контакта индика­торной бумаги с сывороткой до момента, когда цвет этой бумаги сравняется с цветом эталона. Время от 7-й до 21-й минуты свидетельствует о нормальной активности холинэстеразы, меньше 6 мин — о повы­шенной активности, от 41-й до 60-й минуты и более — о резком снижении.

Расхождение результатов в параллельных опреде­лениях не более ± 1 мин.

68

^ Экспресс-метод определения активности сывороточной холинэстеразы с помощью реактивной бумаги «Биофан-С»

Принцип. Сывороточная холинэстераза расщеп­ляет ацетилхолин на холин и уксусную кислоту, кото­рая сдвигает рН в кислую сторону, вследствие чего индикатор соответственно меняет свой цвет — от синего через зеленый к желтому, причем время, прошедшее от момента контакта с сывороткой до появления желтого цвета, пропорционально активности фермента.

Реактивная бумага «Биофан-С» (ГДР) представля­ет собой ленточку, нижний конец которой окрашен в желтый цвет (этот участок пропитан раствором соли ацетилхолина и индикатором, меняющим свой цвет от сдвига рН). На ленточку надет пластмассовый хомутик (для предохранения бумаги от высыхания).

Ход определения. Вынув ленточку, сдвигают пластмассовый хомутик вверх, на секунду погружают желтый конец ленточки в исследуемую сыворотку (при этом он тотчас становится синим, так как рН сыворот­ки слабощелочной), после чего надвигают хомутик на увлажненный конец, прижимая его пальцами к бума­ге. Замечают время по часам и кладут бумажку рядом с цветным эталоном, прилагаемым к компоненту. Мо­мент совпадения цвета бумажки с цветом эталона от­мечают. Если цвет сравнялся через 4 мин или менее, следует говорить о повышении активности холинэстера­зы, от 4 до 15 мин — о нормальной, от 15 до 25 мин— о пониженной, свыше 25 мин—о резко сниженной.

^ Определение мочевины в сыворотке крови по цветной реакции с диацетилмонооксимом

Принцип. Мочевина образует с диацетилмоноок-i симом в присутствии тиосемикарбазида и солей железа в кислой среде окрашенное соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию моче­вины в сыворотке крови и в моче.

Реактивы:

1. 10% раствор трихлоруксусной кислоты.

2. 2,5% водный раствор диацетилмонооксима. Ре­актив стоек.

3. 0,25% водный раствор тиосемикарбазида. Для приготовления реактива можно пользоваться также ти-

69

осемикарбазидом солянокислым, последний применяет­ся в виде 0,32% водного раствора. Оба реактива ста­бильны при хранении в темной посуде при комнатной температуре.

4. Раствор хлорного железа.

Основной раствор хлорного железа: 5 г хлорного железа доводят до 100 мл дистиллированной водой л подкисляют добавлением 1 мл концентрированной сер­ной кислоты.

Из основного раствора готовят рабочий раствор хлорного железа: 1 мл основного раствора хлорного же­леза доводят до 100 мл дистиллированной водой, затем добавляют 8 мл концентрированной серной кислоты и 1 мл 85% ортофосфорной кислоты. Хранят в темной посуде. Годен в течение 2 нед.

5. Цветной реактив: к 30 мл рабочего раствора хлорного железа добавляют 20 мл дистиллированной воды, 1 мл 2,5% раствора диацетилмонооксима и 0,25 мл 0,25% раствора тиосемикарбазида. Цветной ре­актив готовят каждый р^аз перед употреблением.

6. Стандартный раствор мочевины. Готовят 16,65 ммоль/л раствора мочевины (100 мг мочевины растворяют в 100 мл растворителя). В качестве раство­рителя можно использовать дистиллированную воду или 0,2% раствор бензойной кислоты (0,2 г кристалли­ческой бензойной кислоты растворяют в 100 мл дистил­лированной воды при интенсивном перемешивании и нагревании на водяной бане).

Стандарт, приготовленный на растворе бензойной кислоты, более стабилен, чем водный.

Ход определения. В центрифужную пробирку наливают 0,8 мл дистиллированной воды, 0,2 мл сыво­ротки и 1 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты, смешивают. Через 15—20 мин центрифугируют. В чис­тую пробирку вносят 0,5 мл надосадочной жидкости и 5 мл цветного реактива. Пробирку накрывают фольгой и выдерживают на кипящей водяной бане 20 мин, за­тем охлаждают 2—3 мин в холодной воде. Измерение проводят на фотоэлектроколориметре при длине волны 500—560 нм против контроля в кювете с толщиной слоя 1 см.

Контроль ставят, как опытную пробу, но вместо над­осадочной жидкости берут 0,5 мл дистиллированной воды.

70

Стандартная проба: определение стандартной пробы проводят аналогично опытной, но вместо сыворотки бе­рут 0,2 мл стандартного раствора.

Расчет производят по формуле



где х— концентрация мочевины в ммоль/л в сыворот­ке крови;

Eon— экстинкция опытной пробы;
1   ...   4   5   6   7   8   9   10   11   12

Похожие:

Исследование мочи iconИсследование пульса, его характеристики
Осуществление сбора мочи по Зимницкому, Нечипоренко, для общего анализа и на стерильность

Исследование мочи iconКлинический анализ мочи (ока мочи). Материалы, методика, интерпретация результатов
Ют утром в сухую, чистую посуду (флакон для мочи с красной крышкой). Желательно собирать мочу в тот сосуд, в котором она будет доставлена...

Исследование мочи iconЗадача №1
Размер железы 2,8х3,5х3 Остаточной мочи 150 мл. Содержание мочевины в сыворотке крови 7,8 ммоль/л. Общий анализ крови и мочи в норме....

Исследование мочи iconХимизм и энергетика мышечного сокращения. Снефрон как морфофункциональная...
Механизмы фильтрации. Состав первичной мочи. Особенности кровообращения в почке. Л

Исследование мочи iconНочной энурез (НЭ) это состояние непроизвольного мочеиспускания во...
Ночное недержание мочи является «детской болезнью», хотя она может встречаться в любом возрасте. Если мокрые пеленки грудного младенца...

Исследование мочи iconИсследование: установление контакта с сопротивлением 75 Самостоятельное...
Седона-метод: Избавьтесь от эмоциональных проблем и живите так, как всегда мечтали. 1

Исследование мочи iconИсследование: установление контакта с сопротивлением 64 Самостоятельное...
Седона-метод: Избавьтесь от эмоциональных проблем и живите так, как всегда мечтали. 1

Исследование мочи iconИсследование: установление контакта с сопротивлением 64 Самостоятельное...
Седона-метод: Избавьтесь от эмоциональных проблем и живите так, как всегда мечтали. 1

Исследование мочи iconИсследование секрета простаты
Общеклиническое исследование отделяемого мочеполовых органов (клеточный состав, микрофлора)

Исследование мочи iconЭкзаменационные вопросы по дисциплине «Маркетинг»
Процесс маркетинговых исследований. Исследование рынка и исследование потенциальных возможностей фирмы

Вы можете разместить ссылку на наш сайт:
Школьные материалы


При копировании материала укажите ссылку © 2013
контакты
zadocs.ru
Главная страница

Разработка сайта — Веб студия Адаманов