Исследование мочи
Скачать 1.52 Mb.
|
^ Принцип. Величина кровопотери пропорциональна падению относительной плотности крови. Определять относительную плотность можно с помощью серии растворов сульфата меди с заранее известной относительной плотностью. Реактив — основной и рабочие растворы сульфата меди готовят так, как указано в методике определения белка по относительной плотности сыворотки крови. Ход определения. Из пипетки с высоты 1—2 см в отдельные рабочие растворы выпускают по капле кровь и 10 с следят за поведением капли. Относительная плотность раствора, в котором капля в течение 10 с будет находиться во взвешенном состоянии, т. е. не всплывет и не пойдет на дно, будет равна относительной плотности сыворотки. Содержание гемоглобина, величину кровопотери и показатель геглатокрита определяют по табл. 4. Таблица 4 Определение содержания гемоглобина, величины кровопотери и показателя гематокрита
^ Принцип. Основан на большой разнице поглощения света при определенной длине волны (508 нм) ди-нитрофенилгидразонами о-кетоглутаровой кислоты, ща- 63 велево-уксусной и пировиноградной кислот. В результате псреаминирования, происходящего под действием аланип-аминотрансферазы (АЛТ), образуется пиро-виноградная кислота, а при действии аспартат-амино-трансферазы (ACT) — щавелево-уксусная кислота (последняя относительно легко превращается в пировино-градную кислоту). При добавлении к реакционной смеси раствора 2,4-динитрофенилгидразина ферментативный процесс останавливается и образуются гидразо-ны а-кетокислот. По мере увеличения содержания пиро-виноградной кислоты и соответствующего уменьшения содержания а-кетоглутаровой кислоты оптическая плотность смеси гидразонов возрастает. Повышение оптической плотности пропорционально увеличению концентрации пировиноградной кислоты в пробе, что является функцией активности аминотрансфераз. Реактивы: 1. 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,4. 2. Субстрат для определения активности ACT: берут 6 мг а-кетоглутаровой кислоты и 540 мг L-аспарагино-вой кислоты, добавляют 1 н раствор едкого натра до их полного растворения, затем доводят этой же щелочью до рН 7,4 (по индикаторной бумаге) и доливают буферным раствором до 20 мл. Реактив нестоек, поэтому его готовят в небольшом количестве. Сохраняют в рефрижераторе. При приготовлении субстратного раствора в большом количестве его необходимо сохранять в холодильнике в замороженном виде. Перед работой замороженный субстратный раствор должен полностью оттаять. 3. Субстрат для определения активности АЛТ: помещают 6 мг а-кетоглутаровой кислоты и 356 мг L-ала-нина в небольшой химический стакан и добавляют 1 н раствора едкого натра до полного их растворения. Затем этим же раствором едкого натра рН смеси доводят до 7,4 и доливают до 20 мл фосфатным буфером; рН раствора проверяют с помощью индикаторной бумажки. 4. Раствор 2,4-динитрофенилгидразина: 19,8 мг 2,4-динитрофенилгидразина растворяют в 100 мл 1 н раствора соляной кислоты. Раствор хранят в темной склянке. 5. 0,4 н раствор едкого натра. Ход определения активности ACT. В пробирку вносят 0,5 мл буферно-субстратной смеси и помещают в водяную баню при температуре 37° С на 64 10 мин, затем добавляют 0,1 мл сыворотки и инкубируют при температуре 37° С в течение 60 мин. Когда время инкубации опытной пробы подходит к концу, готовят контроль: в пробирке смешивают 0,5 мл буферно-субстратной смеси и 0,1 мл сыворотки, после чего пробы (опытная и контрольная) обрабатывают одновременно. В пробирки добавляют 0,5 мл раствора 2,4-динитро-феннлгидразина и оставляют на 20 мин при комнатной температуре. Затем в каждую пробирку приливают по 5 мл 0,4 н раствора едкого натра и перемешивают. Через 10 мин пробы фотометрируют против воды на фотоэлектроколориметре в кювете толщиной 1 см (светофильтр № 4 с максимумом пропускания в 508 нм). При работе на фотоэлектроколориметре для повышения чувствительности определения следует на пути пучка света в фотоэлектроколориметре ставить дополнительную кювету (толщина рабочего слоя 2 см) с насыщенным раствором сульфата меди, получая при этом сине-зеленый светофильтр, полоса пропускания которого ближе к 508 нм. Ход определения а ктивности АЛТ. В проиирку вносят 0,5 мл буферно-субстратного раствора для определения АЛТ и помещают в водяную баню при температуре 37" С на 10 мин. Затем добавляют 0,1 мл сыворотки и инкубируют в течение 30 мин при температуре 37й С. Дальнейший ход анализа осуществляют так же, как и при определении активности ACT. Расчет. Разность показании фотоэлектроколори-метра между опытной и контрольной пробами указывает на изменение оптической плотности в результате прошедшей ферментативной реакции. Изменение оптической плотности, выраженное в единицах экстинкции и умноженное на 100, можно условно принимать за активность аминотрансфераз. Однако правильнее активность ферментов выражать в микромолях образовавшейся пировиноградной кислоты на 1000 мл сыворотки за 1 ч или в миллимикромолях на 1 л сыворотки за 1 ч. В этом случае расчет активности аминотрансфераз производят с помощью калибровочного графика зависимости оптической плотности от содержания пировиноградной кислоты. При построении калибровочного графика можно пользоваться схемой, приведенной в табл. 5. В пробирки наливают ингредиенты, указанные в табл. 7, перемешивают и через 20 мин добавляют по 5 Зак. 956 65 Та блица В Схема построения стандартного ряда (стандартный раствор пирувата натрия— 11 мг/100 мл)
* При построении калибровочного графика для расчета активности ACT используется субстрат ACT, а активности АЛТ — субстрат АЛТ. 5 мл 0,4 н раствора едкого натра. Пробы оставляют при комнатной температуре на 10 мин и затем фотомет-рируют на фотоэлектроколориметре против контроля на реактивы. Контроль на реактивы ставят, как и стандартные пробы, но вместо раствора пирувата натрия добавляют дистиллированную воду. Активность ACT в норме составляет 100—450 мкмо-лей пировиноградной кислоты на 1 л сыворотки за 1 ч ' инкубации при температуре 37° С; активность АЛТ 0,1—0,68 ммолей пировиноградной кислоты на 1 л сыворотки за 1 ч инкубации при температуре 37° С. Определение активности а-амилазы в сыворотке крови Принцип. Метод основан на определении количества крахмала, оставшегося нерасщепленным после ферментативной реакции. Реактивы: 1. 2% раствор .крахмала: 200 мг растворимого крахмала растирают с несколькими миллилитрами (1—2мл) холодной воды и количественно переносят в кипящую воду. Размешивают и после охлаждения до комнатной температуры доливают до 5 мл водой. 1 Для перевода в международные единицы (микромоль пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за мииуту пра температуре 37° С) результат умножают на 16,7, 2. 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,2; 72 мл 0,1 М раствора NasHPt^ (19,595 г/л) смешивают с 28 мл 0,1 М раствора КНаР04 (14,978 г/л). 3. 3% раствор хлорида натрия. 4. 1 н раствор соляной кислоты. 5. 0,1 н раствор йода: растворяют 30 г йодида калия в 250 мл дистиллированной воды, туда же вносят 12,7 г кристаллического йода и, добавляя дистиллированную воду, доводят объем до 1000 мл. Хранят в темноте. Ход определения. 0,5 мл крахмального раствора смешивают с 0,3 мл фосфатного буфера и 0,1 мл 3% раствора хлорида натрия. Пробирки нагревают в течение 10 мин при температуре 37° С. После этого в опытные пробы добавляют 0,1 мл сыворотки или мочи, а в контроль — 0,1 мл воды. Перемешивают и помещают в термостат на 30 мин при температуре 37° С. Инкубацию прерывают прибавлением 0,1 мл 1 н раствора соляной кислоты. Затем 0,2 мл содержимого пробирки пипеткой переносят в мерную колбу на 50 мл, куда прибавляют 40 мл воды, 0,5 мл 1 н раствора йода и дополняют объем до метки дистиллированной водой. Опытную (Еоп) и контрольную (Ек) пробы фотомет-рируют с помощью ФЭК с красным светофильтром (600—620 нм). Кювета толщиной 1 см. Фотометрию производят против воды: в— оп 10-20=^мг крахмала, Еа гидролизованного 1 мл сыворотки или мочи за 1 ч инкубации при температуре 37°С, где 10 — количество миллиграммов крахмала, введенного в опытную и контрольную пробы; 20 — коэффициент пересчета на 1 мл сыворотки или мочи за 1 ч инкубации. Нормальные показатели активности фермента для сыворотки крови 16—30 г/ч. л, в моче—до 160 мг крахмала, гидролизованного 1 мл биологической жидкости за 1 ч инкубации при температуре 37° С. Экспресс-метод определения активности холинэстеразы с помощью индикаторной бумаги, выпускаемой заводом «Реагент» (г. Рига) Принцип. Холинэстеразная индикаторная бумага представляет собой полоску хроматографической бу- маги размером 65Х10 мм с линией перфорации, отделяющей конец индикаторной бумаги — 20Х10 мм, пропитанной ацетилхолином и индикатором, меняющим цвет в зависимости от рН среды. После контакта исследуемой сыворотки с индикаторной бумагой под влиянием холинэстеразы наступает гидролиз ацетилхолина и освобождается уксусная кислота, которая влияет па рН и меняет цвет индикатора. Реакция должна продолжаться до тех пор, пока рН не достигнет определенного уровня, а соответствующий этому цвет индикаторной бумаги не сравняется с цветом эталона. Мерои активности холинэстеразы является время (мин), на протяжении которого под влиянием исследуемой сыворотки происходит изменение цвета индикатора бумаги вплоть до совпадения с цветом эталона. Ход определения. Пипеткой наносится 0,05 мл сыворотки крови на поверхность химически чистого предметного стекла. Стекло должно лежать на белой бумаге (белый фон). На каплю сыворотки, находящуюся на предметном стекле, помещают пропитанный конец индикаторной бумаги до границы с линией перфорации. Затем быстро накладывают второе предметное стекло, слегка прижимая его для равномерного распределения сыворотки в полоске индикаторной бумаги. Верхнее стекло не следует снимать, чтобы не вьпвать высыхания бумаги. Рядом кладут эталон — полоску бумаги желто-зеленого цвета. Определение должно проводиться при температуре 18—22° С. Индикаторная бумага в сухом виде имеет желтый цвет; после контакта с сывороткой цвет ее становится темно-зеленым или сине-зеленым, а затем меняется в пределах различных оттенков с зеленого цвета и в конце определения сравнивается с желто-зеленым цветом бумаги эталона. Отсчет времени ведется с момента контакта индикаторной бумаги с сывороткой до момента, когда цвет этой бумаги сравняется с цветом эталона. Время от 7-й до 21-й минуты свидетельствует о нормальной активности холинэстеразы, меньше 6 мин — о повышенной активности, от 41-й до 60-й минуты и более — о резком снижении. Расхождение результатов в параллельных определениях не более ± 1 мин. 68 ^ Принцип. Сывороточная холинэстераза расщепляет ацетилхолин на холин и уксусную кислоту, которая сдвигает рН в кислую сторону, вследствие чего индикатор соответственно меняет свой цвет — от синего через зеленый к желтому, причем время, прошедшее от момента контакта с сывороткой до появления желтого цвета, пропорционально активности фермента. Реактивная бумага «Биофан-С» (ГДР) представляет собой ленточку, нижний конец которой окрашен в желтый цвет (этот участок пропитан раствором соли ацетилхолина и индикатором, меняющим свой цвет от сдвига рН). На ленточку надет пластмассовый хомутик (для предохранения бумаги от высыхания). Ход определения. Вынув ленточку, сдвигают пластмассовый хомутик вверх, на секунду погружают желтый конец ленточки в исследуемую сыворотку (при этом он тотчас становится синим, так как рН сыворотки слабощелочной), после чего надвигают хомутик на увлажненный конец, прижимая его пальцами к бумаге. Замечают время по часам и кладут бумажку рядом с цветным эталоном, прилагаемым к компоненту. Момент совпадения цвета бумажки с цветом эталона отмечают. Если цвет сравнялся через 4 мин или менее, следует говорить о повышении активности холинэстеразы, от 4 до 15 мин — о нормальной, от 15 до 25 мин— о пониженной, свыше 25 мин—о резко сниженной. ^ Принцип. Мочевина образует с диацетилмоноок-i симом в присутствии тиосемикарбазида и солей железа в кислой среде окрашенное соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию мочевины в сыворотке крови и в моче. Реактивы: 1. 10% раствор трихлоруксусной кислоты. 2. 2,5% водный раствор диацетилмонооксима. Реактив стоек. 3. 0,25% водный раствор тиосемикарбазида. Для приготовления реактива можно пользоваться также ти- 69 осемикарбазидом солянокислым, последний применяется в виде 0,32% водного раствора. Оба реактива стабильны при хранении в темной посуде при комнатной температуре. 4. Раствор хлорного железа. Основной раствор хлорного железа: 5 г хлорного железа доводят до 100 мл дистиллированной водой л подкисляют добавлением 1 мл концентрированной серной кислоты. Из основного раствора готовят рабочий раствор хлорного железа: 1 мл основного раствора хлорного железа доводят до 100 мл дистиллированной водой, затем добавляют 8 мл концентрированной серной кислоты и 1 мл 85% ортофосфорной кислоты. Хранят в темной посуде. Годен в течение 2 нед. 5. Цветной реактив: к 30 мл рабочего раствора хлорного железа добавляют 20 мл дистиллированной воды, 1 мл 2,5% раствора диацетилмонооксима и 0,25 мл 0,25% раствора тиосемикарбазида. Цветной реактив готовят каждый р^аз перед употреблением. 6. Стандартный раствор мочевины. Готовят 16,65 ммоль/л раствора мочевины (100 мг мочевины растворяют в 100 мл растворителя). В качестве растворителя можно использовать дистиллированную воду или 0,2% раствор бензойной кислоты (0,2 г кристаллической бензойной кислоты растворяют в 100 мл дистиллированной воды при интенсивном перемешивании и нагревании на водяной бане). Стандарт, приготовленный на растворе бензойной кислоты, более стабилен, чем водный. Ход определения. В центрифужную пробирку наливают 0,8 мл дистиллированной воды, 0,2 мл сыворотки и 1 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты, смешивают. Через 15—20 мин центрифугируют. В чистую пробирку вносят 0,5 мл надосадочной жидкости и 5 мл цветного реактива. Пробирку накрывают фольгой и выдерживают на кипящей водяной бане 20 мин, затем охлаждают 2—3 мин в холодной воде. Измерение проводят на фотоэлектроколориметре при длине волны 500—560 нм против контроля в кювете с толщиной слоя 1 см. Контроль ставят, как опытную пробу, но вместо надосадочной жидкости берут 0,5 мл дистиллированной воды. 70 Стандартная проба: определение стандартной пробы проводят аналогично опытной, но вместо сыворотки берут 0,2 мл стандартного раствора. Расчет производят по формуле  где х— концентрация мочевины в ммоль/л в сыворотке крови; Eon— экстинкция опытной пробы; |
Похожие:
 | Осуществление сбора мочи по Зимницкому, Нечипоренко, для общего анализа и на стерильность | | Ют утром в сухую, чистую посуду (флакон для мочи с красной крышкой). Желательно собирать мочу в тот сосуд, в котором она будет доставлена... |
| Размер железы 2,8х3,5х3 Остаточной мочи 150 мл. Содержание мочевины в сыворотке крови 7,8 ммоль/л. Общий анализ крови и мочи в норме.... | | Механизмы фильтрации. Состав первичной мочи. Особенности кровообращения в почке. Л |
| Ночное недержание мочи является «детской болезнью», хотя она может встречаться в любом возрасте. Если мокрые пеленки грудного младенца... | | Седона-метод: Избавьтесь от эмоциональных проблем и живите так, как всегда мечтали. 1 |
| Седона-метод: Избавьтесь от эмоциональных проблем и живите так, как всегда мечтали. 1 | | Седона-метод: Избавьтесь от эмоциональных проблем и живите так, как всегда мечтали. 1 |
| Общеклиническое исследование отделяемого мочеполовых органов (клеточный состав, микрофлора) | | Процесс маркетинговых исследований. Исследование рынка и исследование потенциальных возможностей фирмы |