Исследование мочи
Скачать 1.52 Mb.
|
Ест— экстинкция стандартной пробы; 16,65— концентрация мочевины в стандартном растворе, ммоль/л. Норма 2,5—8,3 ммоль/л. ^ Принцип. Мочевина под действием уреазы разлагается на углекислый газ и аммиак. Аммиак определяется колориметрически по образованию окрашенных продуктов с реактивом Несслера. Реактивы: 1. Соевая мука, содержащая уреазу1. Активность уреазы определяется следующим образом. Берут в пробирку 0,2 мл 0,1% раствора мочевины, прибавляют 1,5 мл воды и около 10 мг соевой муки, смешивают, закрывают плотно резиновой пробкой, помещают в водяную баню при температуре 37—40° С на 20 мин, охлаждают и центрифугируют. К 1 мл центрифугата прибав» ляют 2,5 мл дистиллированной воды и 0,5 мл реактива Несслера. Появление интенсивного желтого окрашивания указывает на присутствие в муке активной уреазы. В контрольном опыте (без мочевины) желтая окраска должна быть едва заметной. 2. Реактив Несслера. В толстостенной колбе на 500 мл приготовляют раствор в составе: б г йода, 8 г йодида калия и 5,5 мл дистиллированной воды. К раствору прибавляют 8 г металлической ртути. Смесь энергично встряхивают до появления светло-желтого окрашивания и после охлаждения под струёй хо- Активную уреазу можно получить также из семян арбуза. Для этого семена освобождают от кожуры и высушивают при комнатной температуре в течение 2 дней. Затем их растирают в фарфоровой ступке и употребляют так же, как соевую муку. 71 лодной воды декантируют в мерную колбу на 50 мл. По отдельной капле жидкости после добавления крахмала убеждаются в наличии свободного йода. При отрицательной реакции на йод добавляют йодный раствор до появления слабо-синего окрашивания и доводят до метки дистиллированной водой. Приготовленный раствор смешивают с 260 мл 10% раствора едкого натра и дают ему стоять в течение суток; после этого реактив годен к употреблению. Сохраняют реактив в темной склянке с резиновой пробкой. 3. 7,5% раствор сернокислого цинка. 4. 1,5% раствор едкого натра. Необходимо, чтобы 10 мл раствора сульфата цинка соответствовали 10,8—11,2 мл раствора щелочи. Для проверки этого берут 10 мл сульфата цинка и титруют 1,5% раствором едкого натра в присутствии фенолфталеина. 5. 0,2% раствор сегнетовой соли. Ход определения. В две центрифужные пробирки вводят по 1,6 мл дистиллированной воды и по 0,1 мл крови и промывают пипетку повторным втягива-нием и выдуванием. Прибавляют в каждую пробирку около 10 мг соевой муки (следует иметь в виду, что избыток муки извращает цветную реакцию), смешивают, плотно закрывают пробкой. Пробирки ставят в водяную баню при температуре 37—40° С на 20 мин, затем охлаждают и осаждают белки, прибавляя по 0,2 мл растворов сульфата цинка и едкого натра. Энергично смешивают, опрокидывая пробирки после каждого прибавления реактивов; затем пробирки, закрытые пробками, центрифугируют. К 1 мл центрифугата (0,05 мл крови) прибавляют 2,5 мл 0,2% раствора сегнетовой соли (для устранения появления мути) и 0,5 мл реактива Несслера. Спустя 2 мин фотометрируют в кювете толщиной 1 см при длине волны 610 нм против воды. В контрольном опыте вместо крови берут 0,1 мл дистиллированной воды. В остальном поступают так же, как и при анализе крови. Из результатов фотометрии пробы крови вычитают данные фотометрии, полученные в контрольном опыте. Расчет производят по калибровочной кривой, построенной с помощью стандартного раствора мочевины. Для этого мочевину высушивают в эксикаторе над си-ликагелем до постоянной массы. Затем 1,0 г мочевины растворяют в 100 мл дистиллированной воды (основной стандартный раствор). Для построения калибровочной кривой берут 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 основного стандартного раствора мочевины и доливают водой до 50 мл, после чего 0,1 мл каждого из этих растворов обрабатывают как опытные пробы. Из Ест вычитают Ец и получают АЕ, которые соответствуют следующим значениям мочевины: 3,33; 6,66; 10,0; 13,3; 16,6 ммоль/л. Полученные значения используют для построения калибровочной кривой. ^ А. С помощью реактивной бумаги «Уранал» (ГДР) Принцип. Мочевина под влиянием фермента уреа-зы разлагается с образованием углекислоты и аммиака по реакции Образующийся при этом аммиак окрашивает в синий цвет желтую бумагу — индикатор; высота окрашенной области пропорциональна количеству аммиака, а следовательно, и концентрации мочевины. Бумага <Уранал» представляет собой бумажную ленточку, один конец которой пропитан раствором фермента уреазы. Эта зона отграничена розовой полоской, выше которой подклеена вторая, более короткая (желтая) ленточка, синеющая от аммиака. Ход определения. Зону уреазы обильно смачивают испытуемой сывороткой (плазмой), тотчас опускают ее в прилагаемую к комплекту пробирочку, которую помещают в вертикальном положении в термостат (при температуре 37—38° С) на 30 мин. По окончании инкубации ленточку вынимают, мягким карандашом отмечают верхнюю границу посиневшей области индикатора и измеряют расстояние (мм) от нижнего края до верхней границы окрашенной области. При высоте окрашенной области до 1 мм содержа- ние мочевины нормальное, от 2 до 3 мм — слеГКа повышенное, от 3 до 5 мм повышенное, выше 5 мм — ситьпо повышенное. Б. С помощью реактивной бумаги «Уреатест» (СССР) Принцип тот же, что и с помощью бумаги «Урп-нал». Ход определения (рис. 16). Исследуемую сы-  Рис. 16. Примерная схема выполнения анализа (экспресс метод опре деления мочевины) воротку (или цельную кровь) разводят дистиллированной водой 1-1. На конец бумажной ленточки, пропитан- Т а бли ц а 6 ______ Калибровочная таблица для бумаги «Уреатест»
Примечание. При очень высоких концентрациях мочевины сыворотку (кровь) следует разводить до степени, при которой посинение индикаторной зоны не превысит 6,0 мм, и результат умножать на разведение. ной ферментом, на расстоянии 3 мм от розовой парафинированной полоски мерной пипеткой наносят 0,03 мм разведенной сыворотки или крови. Затем быстро вносят ленточку в чистую сухую пробирку, закрывают пробкой и оставляют на 20 мин при температуре 37° С в термостате или на 30 мин при температуре 20° С. После этого, вынув ленточку, карандашом отмечают верхнюю границу посиневшего участка и измеряют высоту окрашенной зоны в миллиметрах Концентрацию мочевины оценивают так же, как и при использовании бумаги «Уранал», или по табл 6. ^ и спинномозговой жидкости меркуриметрическим методом с индикатором дифенилкарбазоном Принцип Хлориды в биологических жидкостях титруют нитратом ртути, применяя в качестве индикатора дифенилкарбазон. После полного связывания хлоридов излишек нитрата ртути образует с индикатором комплекс, окрашенный в сине лиловый цвет. Реактивы 1 Раствор нитрата (азотнокислой) ртути. 2—3 г нитрата ртути Hg(NOs)2 • 2НзО (х. ч) растворяют в 200—300 мл дистиллированной воды и добавляют точно 20 мл 2 н раствора азотной кислоты. Раствор доводят водой до 1 л. Раствор стойкий. 2 Раствор индикатора 100 мг дифенилкарбазона растворяют в 100 мл 96° этанола. Раствор хранится в темной склянке в холодильнике в течение месяца 3. 2 н раствор азотной кислоты. 4 Стандартный 0,01 н раствор хлорида натрия: 584,5 мг хлорида натрия (х. ч.), высушенного при температуре 120° С, взвешивают на аналитических весах и растворяют в 1 л дистиллированной воды. 1 мл этого раствора содержит 0,01 ммоль/л хлора. Ход определения. В сахарный стаканчик помещают 1,8 мл дистиллированной воды, добавляют 0,2 мл исследуемой биологической жидкости, 4 капли индикатора и титруют нитратом ртути из микробюретки с делениями на 0,01 мл до появления сине-фиолетового окрашивания (перемена окраски в конечной точке титрования отчетливо заметна). Дтя стандартизации раствора нтрата рпти к 2 мч стандартного раствора хлорида натрия добавляют 4 капли раствора индикатора и титруют раствором нитрата ртути, как и при опыте. Расчет:  где 0,02 — ммоль/л хлора в 2 мл стандартного раствора хлорида натрия; 5х 1000 — коэффициент пересчета на 1000 мл; А — количество раствора нитрата ртути, пошедшее на титрование опыта; Б — количество раствора нитрата ртути, пошедшее на титрование стандартного раствора хлорида натрия. Для удобства в работе количество раствора нитрата ртути, пошедшее на титрование опыта — А, можно ум- , т- " ^ ножить на фактор F, который равен —, так как коли- Б чество раствора нитрата ртути, пошедшее на титрование стандартного раствора хлорида натрия, является постоянной величиной в течение нескольких дней. Раствор нитрата ртути можно готовить из красной окиси ртути. Для этого 1,083 г красной окиси ртути растворяют в 11,0 мл концентрированной азотной кислоты и добавляют водой до 1000 мл. Раствор неограниченно стойкий. Раствор индикатора должен иметь оранжево-красную окраску. Реактив нужно менять, если окраска становится желтой или вишнево-красной, так как в этом случае он не дает отчетливой конечной точки. Удаление белков усиливает изменение цвета в конечной точке, но не является обязательным. Результаты получаются выше на 1—2 ммоль/л, чем результаты с фильтратом сыворотки. Если моча имеет щелочную реакцию (рН>8), необходимо подкислить ее разведенной азотной кислотой до слабокислой реакции. В норме в сыворотке крови хлора 95—110 ммоль/л, в спинномозговой жидкости 120—130 ммоль/л и в моче 170—210 ммоль/л. ^ При гипохлорсмических состояниях бывает важно срочно убедиться в снижении выведения хлоридов с мо- 76 чой. Для этого достаточно проведения экспресс-пробы в первой полученной порции мочи. Ход определения. 3—4 мл мочи в пробирке обильно подкисляют азотной кислотой (прибавлением 2—3 капель концентрированной или 50% раствора азотной кислоты), после чего добавляют приблизительно одну часть на 10 объемов исследуемой мочи 0,1 н раствора нитрата серебра. При большом количестве хлоридов в моче (что бывает в норме) образуется обильный творожистый осадок белого цвета; при уменьшении их концентрации появляется лишь небольшое помутнение. ^ Принцип. Взаимодействие между находящимся в сыворотке исследуемого больного С-реактивным белком (СРВ) и специфической антисывороткой высокого титра ведет к образованию преципитата 1. Оборудование и реактивы: 1. Антисыворотка. 2. Исследуемая сыворотка крови или серозная жидкость. 3. Стеклянные капилляры (отпускаются заводом-изготовителем вместе с антисывороткой). 4. Штатив — им может служить металлический или деревянный пенал, заполненный пластилином. Постановка реакции. Стеклянный капилляр берут посредине двумя пальцами и, держа под углом 40—50°, опускают концом во флакон с антисывороткой, набирая ее на '/з длины капилляра (3 см). Капилляр протирают ватой и опускают тем же концом в исследус- ' Промышленность выпускает антисыворотку жидкой или сухой. Жидкая антисыворотка должна быть прозрачной или слегка опале-сцирующеи, стерильной, специфичной, не содержать неразбивающихся хлопьев, иметь титр не ниже 0,1 мг в ! мл, т. е. образовывать осадок в реакции преципитации в капилляре с С-реактивным белком в концентрации его 0,1 мг в 1 мл. Антисыворотку хранят при температуре от 2 до 10 °С. Срок хранения жидкой антисыворотки 1 год, сухой — 2 года с момента изготовления (титрования). Если при хранении выпадает осадок в антисыворотке, то ее центрифугируют при 2,5 тыс. об/мин в течение 15 мин. После этого данная сыворотка пригодна к употреблению. Сухую антисыворотку перед употреблением разводят в 1 мл дистиллированной воды, после чего используют в реакции преципитации. 77 мую сыворотку или в серозную жидкость (последние набирают также на Уз длины капилляра—3 см). Капилляр снова протирают ватой. При заполнении его не должно быть воздуха между реагентами. Затем капилляр, заполненный на Уз длины, покачивают, перемещая жидкость от одного конца к другому, вследствие чего реагенты перемешиваются (необходимо произвести 10—12 таких перемещений жидкости). Перед установлением капилляра в штатив его следует наклонить, чтобы конец, через который набирали сыворотку, был свободен на 15 мм. Затем этот конец капилляра погружают в пластилин так, чтобы уровень жидкости в нем был выше поверхности пластилина на 10 мм (сыворотка находится на воздушном столбике). Чтобы не вылить содержимое капилляра при фиксации, его следует держать горизонтально, а штатив — вертикально. Реакция проходит при комнатной температуре. Предварительный учет результата реакции производят через 4 ч, после чего капилляр со штативом оставляют на сутки при комнатной температуре или ставят на то же время в холодильный шкаф (температура 2—8° С). Через 24 ч производят окончательный учет результата реакции. Выпадение преципитата (хлопья, осадок) в капилляре указывает на наличие С-реактивного белка в исследуемой сыворотке или серозной жидкости. Результат оценивают в мм длины преципитата. ^ Принцип. Прямой билирубин дает с диазореакти-вом (диазотированной сульфаниловой кислотой) розовое окрашивание, а непрямой билирубин дает такую же окраску после добавления кофеинового реактива. Реактивы: 1. Кофеиновый реактив: 5,0 чистого кофеина, 7,5 г бензойнокислого натрия и 12,5 г ацетата натрия растворяют в 1000 мл дистиллированной воды. Реактив годен в течение 2 нед. 2. Изотонический раствор: 8,5 г хлорида натрия растворяют в 1000 мл дистиллированной воды. 3. Диазореактив № 1: 0,5 г сульфаниловой кислоты растворяют в 250 мл дистиллированной воды при легком нагревании. После охлаждения раствор переливают в мерную колбу на 500 мл и добавляют 7,5 мл соля- 78 ной кислоты (относительная плотность 1,19). Затем доливают в колбу дистиллированную воду до метки, т. е. до 500 мл. Реактив стоек. 4. Диазореактив № 2: 0,5% раствор нитрита (азо-•гистокислого) натрия: 0,25 г нитрита натрия (NaNOa) растворяют в 50 мл дистиллированной воды. Раствор хранят в темной посуде, годен в течение 2 нед. 5. Смесь диазорсактивов: готовят непосредственно перед употреблением смешиванием диазореактивов № 1 и № 2 в соотношении 100:3 (например, 10 мл первого диазореактива смешивают с 0,3 мл второго). 6. Хлороформ для наркоза. 7. Гидрокарбонатный спирт: 60 мл гидрокарбоната натрия (NaHCOs) и 0,3 г хлорида натрия растворяют в 25 мл дистиллированной воды и добавляют 75 мл этилового спирта. 8. Этиловый спирт. Ход определения. Для анализа используют свежую (взятую в день определения) сыворотку крови без следов гемолиза. 1 мл сыворотки разбавляют 1 мл изотонического раствора хлорида натрия. Для одной сыворотки берут 3 пробирки (табл. 7). ^
При определении общего билирубина пробу для развития окраски оставляют на 20 мин. При определении прямого билирубина колориметрирование следует проводить спустя 5—10 мин после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии в реакцию вступает непрямой билирубин. Колориметрируют на фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре (длина волны 536 нм) против воды в кювете с толщиной слоя 5 мм. Из показателей, 79 полученных при колориметрйровании общего и прямого билирубина, вычитают показатель контроля. Расчет производят по калибровочному графику. Находят содержание общего и прямого билирубина в мкмоль/л. Для определения уровня непрямого билирубина из общего его содержания вычитают показатель прямого билирубина. Построение калибровочной кривой. 1. Основной стандартный раствор билирубина. Для построения калибровочного графика можно использовать лишь тот билирубин, 1 мг/100 мл раствор которого при растворении в хлороформе (для наркоза) при температуре 25° С дает абсорбцию от 1,01 до 1,07 при длине волны 453 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. В колбе на 50 мл растворяют 40 мг билирубина в 30—35 мл 0,1 М раствора карбоната натрия (10,6 г безводного карбоната натрия доводят до 1 л дистиллированной водой). Хорошо взбалтывают, не допуская образования пузырьков. Доводят до 50 мл 0,1 М раствором карбоната натрия и несколько раз перемешивают. Раствор стоек только в течение 10 мин от начала приготовления. 2. Рабочий раствор билирубина. К 13,9 мл свежей негемолизированной сыворотки здорового человека добавляют 2,0 мл свежеприготовленного основного стандартного раствора билирубина и 0,1 мл 4 н раствора уксусной кислоты (25 мл ледяной уксусной кислоты доводят до 100 мл дистиллированной водой). Хорошо перемешивают. Рабочий раствор стоек в течение нескольких дней. Он содержит точно на 171 мкмоль/л билирубина больше, чем сыворотка, взятая для приготовления раствора. Чтобы исключить при расчетах количество билирубина, содержащегося в этой сыворотке, при измерении на фотоэлектроколориметре из величин экстин-кции стандартных проб вычитают величины экстинкции соответствующих разведении компенсационной жидкости. Для приготовления компенсационной жидкости сме« шивают 13,9 мл той же сыворотки, которая использовалась для приготовления стандарта билирубина, 2,0 мл 0,1 М раствора карбоната натрия и 0,1 мл 4 н раствора уксусной кислоты. Для построения калибровочного графика готовят ряд разведении с различным содержанием билирубина (табл. 8). Таблица 8 Схема разведения стандартного раствора билирубина
К полученным разведениям прибавляют по 1,75 мл кофеинового реактива и по 0,25 мл диазосмеси. Измерение проводят при тех же условиях, что и с опытными пробами, через 20 мин. Из компенсационной жидкости готовят разведения, аналогичные стандартным (как указано в табл. 8), и далее обрабатывают так же, как стандартные пробы. Разведение сыворотки в 2 раза не учитывают, так как объем стандартных проб в 2 раза больше по сравнению с исследуемым. Содержание общего билирубина в сыворотке крови здорового человека составляет 1,7—20,5 мкмоль/л, из пего 75% приходится на долю непрямого билирубина. |
Похожие:
 | Осуществление сбора мочи по Зимницкому, Нечипоренко, для общего анализа и на стерильность | | Ют утром в сухую, чистую посуду (флакон для мочи с красной крышкой). Желательно собирать мочу в тот сосуд, в котором она будет доставлена... |
| Размер железы 2,8х3,5х3 Остаточной мочи 150 мл. Содержание мочевины в сыворотке крови 7,8 ммоль/л. Общий анализ крови и мочи в норме.... | | Механизмы фильтрации. Состав первичной мочи. Особенности кровообращения в почке. Л |
| Ночное недержание мочи является «детской болезнью», хотя она может встречаться в любом возрасте. Если мокрые пеленки грудного младенца... | | Седона-метод: Избавьтесь от эмоциональных проблем и живите так, как всегда мечтали. 1 |
| Седона-метод: Избавьтесь от эмоциональных проблем и живите так, как всегда мечтали. 1 | | Седона-метод: Избавьтесь от эмоциональных проблем и живите так, как всегда мечтали. 1 |
| Общеклиническое исследование отделяемого мочеполовых органов (клеточный состав, микрофлора) | | Процесс маркетинговых исследований. Исследование рынка и исследование потенциальных возможностей фирмы |