Исследование мочи




НазваниеИсследование мочи
страница9/12
Дата публикации20.12.2013
Размер1.52 Mb.
ТипИсследование
zadocs.ru > Медицина > Исследование
1   ...   4   5   6   7   8   9   10   11   12

Ест— экстинкция стандартной пробы;

16,65— концентрация мочевины в стандартном раство­ре, ммоль/л. Норма 2,5—8,3 ммоль/л.

^ Ферментативный метод определения мочевины в сыворотке крови

Принцип. Мочевина под действием уреазы разла­гается на углекислый газ и аммиак. Аммиак определя­ется колориметрически по образованию окрашенных продуктов с реактивом Несслера.

Реактивы:

1. Соевая мука, содержащая уреазу1. Активность уреазы определяется следующим образом. Берут в про­бирку 0,2 мл 0,1% раствора мочевины, прибавляют 1,5 мл воды и около 10 мг соевой муки, смешивают, за­крывают плотно резиновой пробкой, помещают в водя­ную баню при температуре 37—40° С на 20 мин, охлаж­дают и центрифугируют. К 1 мл центрифугата прибав» ляют 2,5 мл дистиллированной воды и 0,5 мл реактива Несслера. Появление интенсивного желтого окрашива­ния указывает на присутствие в муке активной уреазы. В контрольном опыте (без мочевины) желтая окраска должна быть едва заметной.

2. Реактив Несслера. В толстостенной колбе на 500 мл приготовляют раствор в составе: б г йода, 8 г йодида калия и 5,5 мл дистиллированной воды.

К раствору прибавляют 8 г металлической ртути. Смесь энергично встряхивают до появления светло-жел­того окрашивания и после охлаждения под струёй хо-

Активную уреазу можно получить также из семян арбуза. Для этого семена освобождают от кожуры и высушивают при ком­натной температуре в течение 2 дней. Затем их растирают в фарфо­ровой ступке и употребляют так же, как соевую муку.

71

лодной воды декантируют в мерную колбу на 50 мл. По отдельной капле жидкости после добавления крах­мала убеждаются в наличии свободного йода. При от­рицательной реакции на йод добавляют йодный раст­вор до появления слабо-синего окрашивания и доводят до метки дистиллированной водой. Приготовленный раствор смешивают с 260 мл 10% раствора едкого нат­ра и дают ему стоять в течение суток; после этого реактив годен к употреблению. Сохраняют реактив в темной склянке с резиновой пробкой.

3. 7,5% раствор сернокислого цинка.

4. 1,5% раствор едкого натра.

Необходимо, чтобы 10 мл раствора сульфата цинка соответствовали 10,8—11,2 мл раствора щелочи. Для проверки этого берут 10 мл сульфата цинка и титруют 1,5% раствором едкого натра в присутствии фенолфта­леина.

5. 0,2% раствор сегнетовой соли.

Ход определения. В две центрифужные про­бирки вводят по 1,6 мл дистиллированной воды и по 0,1 мл крови и промывают пипетку повторным втягива-нием и выдуванием. Прибавляют в каждую пробирку около 10 мг соевой муки (следует иметь в виду, что из­быток муки извращает цветную реакцию), смешивают, плотно закрывают пробкой. Пробирки ставят в водяную баню при температуре 37—40° С на 20 мин, затем ох­лаждают и осаждают белки, прибавляя по 0,2 мл раст­воров сульфата цинка и едкого натра. Энергично сме­шивают, опрокидывая пробирки после каждого прибав­ления реактивов; затем пробирки, закрытые пробками, центрифугируют.

К 1 мл центрифугата (0,05 мл крови) прибавляют 2,5 мл 0,2% раствора сегнетовой соли (для устранения появления мути) и 0,5 мл реактива Несслера. Спустя 2 мин фотометрируют в кювете толщиной 1 см при дли­не волны 610 нм против воды.

В контрольном опыте вместо крови берут 0,1 мл дистиллированной воды. В остальном поступают так же, как и при анализе крови. Из результатов фотомет­рии пробы крови вычитают данные фотометрии, полу­ченные в контрольном опыте.

Расчет производят по калибровочной кривой, пост­роенной с помощью стандартного раствора мочевины. Для этого мочевину высушивают в эксикаторе над си-ликагелем до постоянной массы. Затем 1,0 г мочевины

растворяют в 100 мл дистиллированной воды (основной стандартный раствор). Для построения калибровочной кривой берут 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 основного стандарт­ного раствора мочевины и доливают водой до 50 мл, после чего 0,1 мл каждого из этих растворов обрабаты­вают как опытные пробы. Из Ест вычитают Ец и полу­чают АЕ, которые соответствуют следующим значениям мочевины: 3,33; 6,66; 10,0; 13,3; 16,6 ммоль/л. Полу­ченные значения используют для построения калибро­вочной кривой.

^ Экспресс-методы определения концентрации мочевины в сыворотке (плазме) крови с помощью реактивных бумаг «Уранал» и «Уреатест»

А. С помощью реактивной бумаги «Уранал» (ГДР)

Принцип. Мочевина под влиянием фермента уреа-зы разлагается с образованием углекислоты и аммиака по реакции

Образующийся при этом аммиак окрашивает в си­ний цвет желтую бумагу — индикатор; высота окра­шенной области пропорциональна количеству аммиака, а следовательно, и концентрации мочевины.

Бумага <Уранал» представляет собой бумажную ленточку, один конец которой пропитан раствором фер­мента уреазы. Эта зона отграничена розовой полоской, выше которой подклеена вторая, более короткая (жел­тая) ленточка, синеющая от аммиака.

Ход определения. Зону уреазы обильно сма­чивают испытуемой сывороткой (плазмой), тотчас опус­кают ее в прилагаемую к комплекту пробирочку, кото­рую помещают в вертикальном положении в термостат (при температуре 37—38° С) на 30 мин.

По окончании инкубации ленточку вынимают, мяг­ким карандашом отмечают верхнюю границу посинев­шей области индикатора и измеряют расстояние (мм) от нижнего края до верхней границы окрашенной обла­сти. При высоте окрашенной области до 1 мм содержа-

ние мочевины нормальное, от 2 до 3 мм — слеГКа по­вышенное, от 3 до 5 мм повышенное, выше 5 мм — ситьпо повышенное.

Б. С помощью реактивной бумаги «Уреатест» (СССР)

Принцип тот же, что и с помощью бумаги «Урп-нал».

Ход определения (рис. 16). Исследуемую сы-



Рис. 16. Примерная схема выполне­ния анализа (экспресс метод опре деления мочевины)

воротку (или цельную кровь) разводят дистиллирован­ной водой 1-1. На конец бумажной ленточки, пропитан-

Т а бли ц а 6 ______ Калибровочная таблица для бумаги «Уреатест»

Высота окрашен

H01I ЗОНЫ, ММ

Концентрация моче вины, ммоль/л

Высота окрашен­ной .lOIIbl MM

Концентрация мочевины,

ммоль/л

1.0

1,7

5,5

9,2

1,5

2,э

6,0

10,0

2,0

3,3

6,5

10,7

2,5

4,2

7,0

11,2

3,0

5,3

7,5

11,7

3,5

5,8

8,0

12,3

4.0

6,7

8,5

13,0

4,5

7,5

9,0

13,7

5,0

8,3

9,5

14,3





13,0

15,0


Примечание. При очень высоких концентрациях мочевины сыворотку (кровь) следует разводить до степени, при которой поси­нение индикаторной зоны не превысит 6,0 мм, и результат умножать на разведение.

ной ферментом, на расстоянии 3 мм от розовой парафи­нированной полоски мерной пипеткой наносят 0,03 мм разведенной сыворотки или крови. Затем быстро вносят ленточку в чистую сухую пробирку, закрывают проб­кой и оставляют на 20 мин при температуре 37° С в термостате или на 30 мин при температуре 20° С. По­сле этого, вынув ленточку, карандашом отмечают верх­нюю границу посиневшего участка и измеряют высоту окрашенной зоны в миллиметрах Концентрацию моче­вины оценивают так же, как и при использовании бу­маги «Уранал», или по табл 6.

^ Определение хлора в сыворотке крови, моче

и спинномозговой жидкости меркуриметрическим

методом с индикатором дифенилкарбазоном

Принцип Хлориды в биологических жидкостях титруют нитратом ртути, применяя в качестве индика­тора дифенилкарбазон. После полного связывания хло­ридов излишек нитрата ртути образует с индикатором комплекс, окрашенный в сине лиловый цвет.

Реактивы

1 Раствор нитрата (азотнокислой) ртути. 2—3 г нитрата ртути Hg(NOs)2 • 2НзО (х. ч) растворяют в 200—300 мл дистиллированной воды и добавляют точно 20 мл 2 н раствора азотной кислоты. Раствор доводят водой до 1 л. Раствор стойкий.

2 Раствор индикатора 100 мг дифенилкарбазона растворяют в 100 мл 96° этанола. Раствор хранится в темной склянке в холодильнике в течение месяца

3. 2 н раствор азотной кислоты.

4 Стандартный 0,01 н раствор хлорида натрия:

584,5 мг хлорида натрия (х. ч.), высушенного при тем­пературе 120° С, взвешивают на аналитических весах и растворяют в 1 л дистиллированной воды. 1 мл этого раствора содержит 0,01 ммоль/л хлора.

Ход определения. В сахарный стаканчик поме­щают 1,8 мл дистиллированной воды, добавляют 0,2 мл исследуемой биологической жидкости, 4 капли индика­тора и титруют нитратом ртути из микробюретки с де­лениями на 0,01 мл до появления сине-фиолетового окрашивания (перемена окраски в конечной точке тит­рования отчетливо заметна).

Дтя стандартизации раствора нтрата рпти к 2 мч стандартного раствора хлорида натрия добавляют 4

капли раствора индикатора и титруют раствором нит­рата ртути, как и при опыте. Расчет:



где 0,02 — ммоль/л хлора в 2 мл стандартного раст­вора хлорида натрия;

5х 1000 — коэффициент пересчета на 1000 мл;

А — количество раствора нитрата ртути, пошед­шее на титрование опыта;

Б — количество раствора нитрата ртути, пошед­шее на титрование стандартного раствора хлорида натрия.

Для удобства в работе количество раствора нитрата ртути, пошедшее на титрование опыта — А, можно ум-

, т- " ^ ножить на фактор F, который равен —, так как коли-

Б чество раствора нитрата ртути, пошедшее на титрова­ние стандартного раствора хлорида натрия, является постоянной величиной в течение нескольких дней.

Раствор нитрата ртути можно готовить из красной окиси ртути. Для этого 1,083 г красной окиси ртути ра­створяют в 11,0 мл концентрированной азотной кислоты и добавляют водой до 1000 мл. Раствор неограниченно стойкий.

Раствор индикатора должен иметь оранжево-крас­ную окраску. Реактив нужно менять, если окраска ста­новится желтой или вишнево-красной, так как в этом случае он не дает отчетливой конечной точки.

Удаление белков усиливает изменение цвета в ко­нечной точке, но не является обязательным. Результаты получаются выше на 1—2 ммоль/л, чем результаты с фильтратом сыворотки.

Если моча имеет щелочную реакцию (рН>8), необ­ходимо подкислить ее разведенной азотной кислотой до слабокислой реакции.

В норме в сыворотке крови хлора 95—110 ммоль/л, в спинномозговой жидкости 120—130 ммоль/л и в моче 170—210 ммоль/л.

^ Экспресс-метод определения хлоридов в моче

При гипохлорсмических состояниях бывает важно срочно убедиться в снижении выведения хлоридов с мо-

76

чой. Для этого достаточно проведения экспресс-пробы в первой полученной порции мочи.

Ход определения. 3—4 мл мочи в пробирке обильно подкисляют азотной кислотой (прибавлением 2—3 капель концентрированной или 50% раствора азот­ной кислоты), после чего добавляют приблизительно одну часть на 10 объемов исследуемой мочи 0,1 н раст­вора нитрата серебра.

При большом количестве хлоридов в моче (что бы­вает в норме) образуется обильный творожистый оса­док белого цвета; при уменьшении их концентрации по­является лишь небольшое помутнение.

^ Определение С-реактивного белка

Принцип. Взаимодействие между находящимся в сыворотке исследуемого больного С-реактивным белком (СРВ) и специфической антисывороткой высокого тит­ра ведет к образованию преципитата 1.

Оборудование и реактивы:

1. Антисыворотка.

2. Исследуемая сыворотка крови или серозная жид­кость.

3. Стеклянные капилляры (отпускаются заводом-из­готовителем вместе с антисывороткой).

4. Штатив — им может служить металлический или деревянный пенал, заполненный пластилином.

Постановка реакции. Стеклянный капилляр берут посредине двумя пальцами и, держа под углом 40—50°, опускают концом во флакон с антисывороткой, набирая ее на '/з длины капилляра (3 см). Капилляр протирают ватой и опускают тем же концом в исследус-

' Промышленность выпускает антисыворотку жидкой или сухой. Жидкая антисыворотка должна быть прозрачной или слегка опале-сцирующеи, стерильной, специфичной, не содержать неразбивающих­ся хлопьев, иметь титр не ниже 0,1 мг в ! мл, т. е. образовывать осадок в реакции преципитации в капилляре с С-реактивным белком в концентрации его 0,1 мг в 1 мл. Антисыворотку хранят при тем­пературе от 2 до 10 °С.

Срок хранения жидкой антисыворотки 1 год, сухой — 2 года с момента изготовления (титрования). Если при хранении выпадает осадок в антисыворотке, то ее центрифугируют при 2,5 тыс. об/мин в течение 15 мин. После этого данная сыворотка пригодна к упо­треблению. Сухую антисыворотку перед употреблением разводят в 1 мл дистиллированной воды, после чего используют в реакции преципитации.

77

мую сыворотку или в серозную жидкость (последние набирают также на Уз длины капилляра—3 см).

Капилляр снова протирают ватой. При заполнении его не должно быть воздуха между реагентами. Затем капилляр, заполненный на Уз длины, покачивают, пере­мещая жидкость от одного конца к другому, вследствие чего реагенты перемешиваются (необходимо произвести 10—12 таких перемещений жидкости).

Перед установлением капилляра в штатив его следу­ет наклонить, чтобы конец, через который набирали сыворотку, был свободен на 15 мм. Затем этот конец капилляра погружают в пластилин так, чтобы уровень жидкости в нем был выше поверхности пластилина на 10 мм (сыворотка находится на воздушном столбике). Чтобы не вылить содержимое капилляра при фиксации, его следует держать горизонтально, а штатив — верти­кально. Реакция проходит при комнатной температуре. Предварительный учет результата реакции производят через 4 ч, после чего капилляр со штативом оставляют на сутки при комнатной температуре или ставят на то же время в холодильный шкаф (температура 2—8° С).

Через 24 ч производят окончательный учет результа­та реакции. Выпадение преципитата (хлопья, осадок) в капилляре указывает на наличие С-реактивного белка в исследуемой сыворотке или серозной жидкости. Резуль­тат оценивают в мм длины преципитата.

^ Определение общего билирубина и его фракций в сыворотке крови по Иендрашику

Принцип. Прямой билирубин дает с диазореакти-вом (диазотированной сульфаниловой кислотой) розо­вое окрашивание, а непрямой билирубин дает такую же окраску после добавления кофеинового реактива.

Реактивы:

1. Кофеиновый реактив: 5,0 чистого кофеина, 7,5 г бензойнокислого натрия и 12,5 г ацетата натрия раст­воряют в 1000 мл дистиллированной воды. Реактив го­ден в течение 2 нед.

2. Изотонический раствор: 8,5 г хлорида натрия ра­створяют в 1000 мл дистиллированной воды.

3. Диазореактив № 1: 0,5 г сульфаниловой кислоты растворяют в 250 мл дистиллированной воды при лег­ком нагревании. После охлаждения раствор перелива­ют в мерную колбу на 500 мл и добавляют 7,5 мл соля-

78

ной кислоты (относительная плотность 1,19). Затем

доливают в колбу дистиллированную воду до метки, т. е. до 500 мл. Реактив стоек.

4. Диазореактив № 2: 0,5% раствор нитрита (азо-•гистокислого) натрия: 0,25 г нитрита натрия (NaNOa) растворяют в 50 мл дистиллированной воды. Раствор хранят в темной посуде, годен в течение 2 нед.

5. Смесь диазорсактивов: готовят непосредственно перед употреблением смешиванием диазореактивов № 1 и № 2 в соотношении 100:3 (например, 10 мл первого диазореактива смешивают с 0,3 мл второго).

6. Хлороформ для наркоза.

7. Гидрокарбонатный спирт: 60 мл гидрокарбоната натрия (NaHCOs) и 0,3 г хлорида натрия растворяют в 25 мл дистиллированной воды и добавляют 75 мл эти­лового спирта.

8. Этиловый спирт.

Ход определения. Для анализа используют све­жую (взятую в день определения) сыворотку крови без следов гемолиза. 1 мл сыворотки разбавляют 1 мл изото­нического раствора хлорида натрия. Для одной сыворот­ки берут 3 пробирки (табл. 7).

^ Таблица 7 Схема определения общего и прямого билирубина

Ингредиенты

Пробирка № 1 (общин били­рубин), мл

Пробирка №2 (прямой би­лирубин), мл

Пробирка № 3 (контроль на сыворотку), мл

Разбавленная сыворотка

0,5

0,5

0.5

Кофеиновый реактив Смесь диазореактивов

1,75 0,25

0,25

1,75

Изотонический раствор



1,75

0,23

хлорида натрия








При определении общего билирубина пробу для раз­вития окраски оставляют на 20 мин. При определении прямого билирубина колориметрирование следует про­водить спустя 5—10 мин после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии в реакцию вступает непрямой билирубин.

Колориметрируют на фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре (длина волны 536 нм) против воды в кювете с толщиной слоя 5 мм. Из показателей,

79

полученных при колориметрйровании общего и прямого билирубина, вычитают показатель контроля.

Расчет производят по калибровочному графику. Находят содержание общего и прямого билирубина в мкмоль/л. Для определения уровня непрямого билиру­бина из общего его содержания вычитают показатель прямого билирубина.

Построение калибровочной кривой. 1. Основной стандартный раствор билирубина. Для построения калибровочного графика можно использо­вать лишь тот билирубин, 1 мг/100 мл раствор которого при растворении в хлороформе (для наркоза) при тем­пературе 25° С дает абсорбцию от 1,01 до 1,07 при дли­не волны 453 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

В колбе на 50 мл растворяют 40 мг билирубина в 30—35 мл 0,1 М раствора карбоната натрия (10,6 г без­водного карбоната натрия доводят до 1 л дистиллиро­ванной водой). Хорошо взбалтывают, не допуская обра­зования пузырьков. Доводят до 50 мл 0,1 М раствором карбоната натрия и несколько раз перемешивают. Ра­створ стоек только в течение 10 мин от начала приготов­ления.

2. Рабочий раствор билирубина. К 13,9 мл свежей негемолизированной сыворотки здорового человека до­бавляют 2,0 мл свежеприготовленного основного стан­дартного раствора билирубина и 0,1 мл 4 н раствора уксусной кислоты (25 мл ледяной уксусной кислоты до­водят до 100 мл дистиллированной водой). Хорошо пе­ремешивают. Рабочий раствор стоек в течение несколь­ких дней. Он содержит точно на 171 мкмоль/л билиру­бина больше, чем сыворотка, взятая для приготовления раствора. Чтобы исключить при расчетах количество билирубина, содержащегося в этой сыворотке, при из­мерении на фотоэлектроколориметре из величин экстин-кции стандартных проб вычитают величины экстинкции соответствующих разведении компенсационной жидко­сти.

Для приготовления компенсационной жидкости сме« шивают 13,9 мл той же сыворотки, которая использова­лась для приготовления стандарта билирубина, 2,0 мл 0,1 М раствора карбоната натрия и 0,1 мл 4 н раствора уксусной кислоты.

Для построения калибровочного графика готовят ряд разведении с различным содержанием билирубина (табл. 8).

Таблица 8 Схема разведения стандартного раствора билирубина

Номер пробирки

Рабочий paciBop билирубина,

мл

О.'}".';! раствор хлорида нат­рия, мл

Количество бн-лирубина в про­бе мкмоль

Концентрация билирубина и сыворотке

КрОВИ, MKMO.ib/Л

1

0,05

0,45

0,0383

17.1

2

0,1

0,4

0,017

34,2

3

0,15

п чч

U , OJ

0,0255

51,3

4

Л 9 11,4

0,3

0,031

68,4

5

0,25

0,25

0,0425

85,5


К полученным разведениям прибавляют по 1,75 мл кофеинового реактива и по 0,25 мл диазосмеси. Измере­ние проводят при тех же условиях, что и с опытными пробами, через 20 мин.

Из компенсационной жидкости готовят разведения, аналогичные стандартным (как указано в табл. 8), и далее обрабатывают так же, как стандартные пробы.

Разведение сыворотки в 2 раза не учитывают, так как объем стандартных проб в 2 раза больше по срав­нению с исследуемым.

Содержание общего билирубина в сыворотке крови здорового человека составляет 1,7—20,5 мкмоль/л, из пего 75% приходится на долю непрямого билирубина.
1   ...   4   5   6   7   8   9   10   11   12

Похожие:

Исследование мочи iconИсследование пульса, его характеристики
Осуществление сбора мочи по Зимницкому, Нечипоренко, для общего анализа и на стерильность

Исследование мочи iconКлинический анализ мочи (ока мочи). Материалы, методика, интерпретация результатов
Ют утром в сухую, чистую посуду (флакон для мочи с красной крышкой). Желательно собирать мочу в тот сосуд, в котором она будет доставлена...

Исследование мочи iconЗадача №1
Размер железы 2,8х3,5х3 Остаточной мочи 150 мл. Содержание мочевины в сыворотке крови 7,8 ммоль/л. Общий анализ крови и мочи в норме....

Исследование мочи iconХимизм и энергетика мышечного сокращения. Снефрон как морфофункциональная...
Механизмы фильтрации. Состав первичной мочи. Особенности кровообращения в почке. Л

Исследование мочи iconНочной энурез (НЭ) это состояние непроизвольного мочеиспускания во...
Ночное недержание мочи является «детской болезнью», хотя она может встречаться в любом возрасте. Если мокрые пеленки грудного младенца...

Исследование мочи iconИсследование: установление контакта с сопротивлением 75 Самостоятельное...
Седона-метод: Избавьтесь от эмоциональных проблем и живите так, как всегда мечтали. 1

Исследование мочи iconИсследование: установление контакта с сопротивлением 64 Самостоятельное...
Седона-метод: Избавьтесь от эмоциональных проблем и живите так, как всегда мечтали. 1

Исследование мочи iconИсследование: установление контакта с сопротивлением 64 Самостоятельное...
Седона-метод: Избавьтесь от эмоциональных проблем и живите так, как всегда мечтали. 1

Исследование мочи iconИсследование секрета простаты
Общеклиническое исследование отделяемого мочеполовых органов (клеточный состав, микрофлора)

Исследование мочи iconЭкзаменационные вопросы по дисциплине «Маркетинг»
Процесс маркетинговых исследований. Исследование рынка и исследование потенциальных возможностей фирмы

Вы можете разместить ссылку на наш сайт:
Школьные материалы


При копировании материала укажите ссылку © 2013
контакты
zadocs.ru
Главная страница

Разработка сайта — Веб студия Адаманов